CTAB法提取植物总DNA

实验概要

CTAB法是一种快速简便的提取植物总DNA的方法，通过实验掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。
 
 

实验原理

CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。采用机械破碎植物细胞，然后加入CTAB分离缓冲液将DNA溶解出来，再经氯仿－异戊醇抽提除去蛋白质，最后得到DNA。
 
 

主要 试剂

2×CTAB提取缓冲液  [ 详细信息：100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),20mmol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl, 2%(w/v)CTAB，40mmol/L 巯基乙醇(随用随加) ]
TE 缓冲液 [ 详细信息：10mmol/L Tris-HCL  （pH7.4），1mmol/L EDTA ]
氯仿-异戊醇（24 ：1）
70% 乙醇
液氮
 

主要设备

冷冻高速离心机
台式高速离心机
移液器
水浴锅
陶瓷研钵
离心管 [ 详细信息：50ml，有盖 ]
离心管 [ 详细信息：5ml和1.5ml ]
小玻棒 [ 详细信息：形状为弯成钩状的 ]
 

实验步骤

1. 取1-50g新鲜植物材料，于液氮中研成粉。
2. 将冻粉转入预冷的 离心管 中，立即加入等体积(w/v) 2×CTAB提取缓冲液，65℃保温10-20分钟，其间不时摇动。
3. 加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒 离心管 混匀，室温下，12000r/min 离心10-20分钟。
4. 将上清液转入另一离心管中,加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，室温、12000r/min 离心10分钟。
5. 将上层水相转入新的经硅烷化处理的离心管中，加入0.6-1倍体积的异丙醇,混匀，室温下放置30分钟。
6. 3500-4000r/min 离心5-10分钟，去上清液, 70%乙醇漂洗，沉淀吹干。
7. 风干后加入40ul的TE 缓冲液 溶解DNA，-20℃保存备用。。
8. 取2ul溶液电泳检测。
 
 

注意事项

所有操作均须温和，避免剧烈震荡。