植物基因组总DNA的分离—CTAB法
互联网
1484
一、实验目的
1、了解植物DNA分离的原理与方法。
２、掌握CTAB法大量分离植物DNA的方法与技术。
二、实验原理
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性。将植物叶片在液氮中研磨，用CATB处理，用氯仿-异戊醇除蛋白质，便可分离到DNA。
三、实验材料
植物新鲜叶片
四、器具及药品
电子天平，研钵， 离心管 ，恒温水浴锅，冷冻离心机，冰箱，微型离心机，紫外分析仪，紫外可见分光光度计，微波炉，液氮，提取缓冲液[2%（w/v）CTAB，2% PVP （polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮），100 mmol·L -1 Tris-HCl，20 mmol·L -1 EDTA，1.4 mol·L -1 NaCl，pH8.0，灭菌后室温保存；用前加入巯基乙醇至终浓度为2%]，氯仿，异戊醇，TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）。
五、实验步骤
1、向10 mL 离心管 中加入5 mL CTAB法植物总DNA抽提Buffer及相应量β-巯基乙醇，65℃预热；
2、1.00 g幼叶用液氮磨成粉末，迅速用药勺转入预热的Buffer中，迅速混匀；
3、65℃ 水浴 45 min，中途间隔（轻柔）振荡三次混匀；
4、 冷却后加入4 mL氯仿：异戊醇（24：1），轻柔颠倒混匀使乳化10 min；
5、8000 ×g，18℃，离心10 min，取上清，重复一次；
6、取上清液，加入等体积室温异丙醇，颠倒混匀；
7、用枪口剪大的1.5mL Tip头吸出DNA沉淀，转入盛有1mL 75%乙醇的1.5mL Eppendorf管中；
8、在75%乙醇中漂洗DNA数次，无水乙醇漂洗一次；
9、沉淀于室温干燥后用500μL TE溶解沉淀，同时加入60μg无DNase的RNaseA；
10、65℃水解RNA 30 min以上；
11、10000 ×g常温离心10 min；
12、吸取上清，加入500 μL酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），轻轻颠倒混匀10 min；
13、10000 ×g常温离心10 min；
14、吸取上清，加入500 μL氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒10 min；
15、10000 ×g常温离心10 min；
16、吸取上清，加入1/10体积的pH 5.2的3 mol·L -1 NaAc,并加入2.5倍体积无水乙醇；
17、8000 ×g常温离心2 min；
18、弃上清，沉淀用75％乙醇500 μL漂洗3次；
19、室温干燥沉淀，溶入100-200 μL重蒸水；
20、电泳及 分光光度计 检测，DNA浓度C（μg·μL -1 ） = 50 × OD 260 ×稀释倍数·10 -3 ， OD 260 /OD 280 一般要求在1.6以上可用。
附CTAB提取缓冲液的配制：
3%CTAB（W/V），1.4mol/L NaCl，0.2%巯基乙醇（V/V），20mmol/L EDTA ，100mmol/L Tris-HCl（PH8.0）
CTAB（cetyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化胺）法植物总DNA抽提Buffer：2%（w/v）CTAB，2% PVP （polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮），100 mmol·L -1 Tris-HCl（pH8.0），20 mmol·L -1 EDTA ，1.4 mol·L -1 NaCl，pH8.0，灭菌后室温保存。用前加入巯基乙醇至终浓度为2%。
1、了解植物DNA分离的原理与方法。
２、掌握CTAB法大量分离植物DNA的方法与技术。
二、实验原理
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性。将植物叶片在液氮中研磨，用CATB处理，用氯仿-异戊醇除蛋白质，便可分离到DNA。
三、实验材料
植物新鲜叶片
四、器具及药品
电子天平，研钵， 离心管 ，恒温水浴锅，冷冻离心机，冰箱，微型离心机，紫外分析仪，紫外可见分光光度计，微波炉，液氮，提取缓冲液[2%（w/v）CTAB，2% PVP （polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮），100 mmol·L -1 Tris-HCl，20 mmol·L -1 EDTA，1.4 mol·L -1 NaCl，pH8.0，灭菌后室温保存；用前加入巯基乙醇至终浓度为2%]，氯仿，异戊醇，TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）。
五、实验步骤
1、向10 mL 离心管 中加入5 mL CTAB法植物总DNA抽提Buffer及相应量β-巯基乙醇，65℃预热；
2、1.00 g幼叶用液氮磨成粉末，迅速用药勺转入预热的Buffer中，迅速混匀；
3、65℃ 水浴 45 min，中途间隔（轻柔）振荡三次混匀；
4、 冷却后加入4 mL氯仿：异戊醇（24：1），轻柔颠倒混匀使乳化10 min；
5、8000 ×g，18℃，离心10 min，取上清，重复一次；
6、取上清液，加入等体积室温异丙醇，颠倒混匀；
7、用枪口剪大的1.5mL Tip头吸出DNA沉淀，转入盛有1mL 75%乙醇的1.5mL Eppendorf管中；
8、在75%乙醇中漂洗DNA数次，无水乙醇漂洗一次；
9、沉淀于室温干燥后用500μL TE溶解沉淀，同时加入60μg无DNase的RNaseA；
10、65℃水解RNA 30 min以上；
11、10000 ×g常温离心10 min；
12、吸取上清，加入500 μL酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），轻轻颠倒混匀10 min；
13、10000 ×g常温离心10 min；
14、吸取上清，加入500 μL氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒10 min；
15、10000 ×g常温离心10 min；
16、吸取上清，加入1/10体积的pH 5.2的3 mol·L -1 NaAc,并加入2.5倍体积无水乙醇；
17、8000 ×g常温离心2 min；
18、弃上清，沉淀用75％乙醇500 μL漂洗3次；
19、室温干燥沉淀，溶入100-200 μL重蒸水；
20、电泳及 分光光度计 检测，DNA浓度C（μg·μL -1 ） = 50 × OD 260 ×稀释倍数·10 -3 ， OD 260 /OD 280 一般要求在1.6以上可用。
附CTAB提取缓冲液的配制：
3%CTAB（W/V），1.4mol/L NaCl，0.2%巯基乙醇（V/V），20mmol/L EDTA ，100mmol/L Tris-HCl（PH8.0）
CTAB（cetyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化胺）法植物总DNA抽提Buffer：2%（w/v）CTAB，2% PVP （polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮），100 mmol·L -1 Tris-HCl（pH8.0），20 mmol·L -1 EDTA ，1.4 mol·L -1 NaCl，pH8.0，灭菌后室温保存。用前加入巯基乙醇至终浓度为2%。
