IL-2的体外诱生
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2023
IL-2 的体外诱生
IL-2主要由活化的CD4+ T细胞产生，主要是促进T淋巴细胞的增殖与分化。IL-2是机体免疫网络中最重要的细胞因子，因此IL-2的检测已成为评价机体免疫功能状态的重要指标之一。但由于IL-2是通过自分泌或旁分泌方式发挥其生物学效应的，在生理性免疫应答过程中，IL-2不出现于血液等体液中，故体液中IL-2含量极少，难以直接测定，通常是通过检测体外诱生的IL-2来反映体内IL-1活性水平。IL-2可用免疫学方法来检测其含量，但更多是用生物活性检测法来检测其活性单位。
【基本原理】
PHA或ConA是IL-2的诱生物，能在体外诱导人外周血单个核细胞和组织细胞（如人脾脏、扁桃体、淋巴结）、小鼠和大鼠脾脏细胞等产生IL-2，由此可用于检测IL-2的生物活性。
1、人外周血单个核细胞诱生IL-2
【材料和试剂】
（1） 常规分离的外周血单个核细胞（PBMC）
（2） RPMI-1640培养液，含10% FCS的RPMI-1640完全培养液
（3） PHA（初浓度为2mg/ml）
（4） 刻度吸管，毛细吸管，加样器（头），刻度离心血管，离心机，细胞计数板，倒置显微镜，24孔细胞培养板，超净工作台，CO2 培养箱，0.22um滤膜及滤器。
【操作步骤】
（1） 常规分离PBMC（参见第六章）；
（2） 用RPMI-1640培养液将PBMC洗涤2次，1000r/min离心10min，然后用10%FCS-RPMI-1640完全培养液调细胞浓度为1×106 /ml；
（3） 将上述细胞悬液加入24孔培养板中，1ml /孔，同时加入PHA，使PHA的终浓度为100μg / ml；
（4） 置37℃，5% CO2 培养箱中培养48h；
（5） 将培养的细胞充分混匀后，转移至离心管中，2000r/min离心20min；
（6） 收集细胞培养上清液，即获得IL-2待测样品，用0.22μm或0.45μm滤膜滤除杂质，分装保存于-20℃或-70℃冰箱待测IL-2活性。
2、小鼠脾脏细胞诱生IL-2
【材料和试剂】
（1） BALB/c或C57BL/6小鼠：6-10周龄，雌雄均可。
（2） 75%酒精；
（3） 蒸馏水或0.83%氯化铵溶液（破红细胞用）
（4） ConA
（5） 2% FCS-HBSS，10% FCS-RPMI-1640完全培养液
（6） 解剖刀、剪，无菌平皿，100目钢网，研磨工具（玻璃匀浆器、不诱钢网或毛玻璃片等），刻度吸管，毛细吸管，刻度离心管，离心机，细胞计数板，倒置显微镜，加样器（头），24孔培养板，超净工作台，CO2 培养箱，0.22um滤膜及滤器等。
【操作步骤】
（1） 拉颈处死小鼠，浸泡于75%酒精中3-5min，清毒处理；
（2） 无菌操作取出脾脏，仔细剪碎或研磨，加适量2% FCS-HBSS混悬细胞，经100目钢网过滤，即获得单个脾细胞悬液；
（3） 将获得的单个脾细胞用蒸馏水或0.83%氯化铵处理，裂解残存的红细胞。
（4） 用2% FCS-HBSS洗涤细胞2次，1000/min离心10min，然后用含10%FCS-RPMI-1640完全培养液调细胞浓度为5×106 /ml；
（5） 将上述脾细胞悬液加入24孔培养板，1ml/孔，再加入ConA，使其终浓渡为5-10μg/ml；
（6） 置37℃、5% CO2 培养箱中培养24-48h（视细胞转化情况而定）；
（7） 将培养的细胞充分震荡混匀后，移至离心管中，2000r/min离心20min；
（8） 收集上清液，即获IL-2待测样品。用0.22μm或0.45μm滤膜滤除杂质，分装保存于-20℃或-70℃冰箱，待测IL-2的生物活性。
【注意事项】
（1） IL-2诱生剂浓度、细胞浓渡、培养条件和诱生时间对IL-2诱生结果均有明显影响，应进行预试验确定最佳实验条件。
（2） 细胞悬液的均匀程度及细胞存活率对结果亦有影响。
（3） 研磨条件：可用玻璃匀浆器、不诱钢网等研磨脾脏。
（4） 培养器皿：24孔培养板培养细胞存活率较高，但生长稍慢。玻璃瓶培养有时会因玻璃质量和清洗不净引起细胞死亡。
（5） 本试验系统均应无菌操作，防止可能出现的污染。
