可溶性蛋白抗原特异性Th克隆的制备

与可溶性蛋白抗原反应的特异性Th克隆的制备需体内致敏，以及需要同系脾细胞作为抗原提呈细胞。有两种类型的辅助T细胞，即分泌IL-2的Th1和分泌IL-4的Th2，前者在克隆时需加入IFN-γ。

材料和试剂：

1. 免疫用动物；

2. 蛋白抗原和完全福氏佐剂（CFA）；

3. 完全RPMI-1640培养液；

4. 生长因子的来源：可用ConA刺激上清或MLC培养上清，另外亦可用重组淋巴因子作为IL-2和IFN-γ的来源；

5. 动物免疫及单个细胞制备所需的其他试剂和器材。

操作步骤：

1. Th克隆的诱导：以可溶性蛋白抗原加CFA作基础免疫动物，7 d后取其淋巴结制备单个细胞悬液。将2×10⁶ 淋巴结细胞加入24孔培养板孔中，同时加入蛋白抗原和6×10⁶ 经2000rad照射的同系脾细胞，总体积为2ml。置37℃，5%CO₂ 温箱培养6～8d。

2. Th1克隆的诱导：在96孔板各孔加入50μl Th细胞悬液(≤2000/ml)，50μl经过照射的同系脾细胞(2×10⁷ /ml)，50μl抗原(200～1600μg/ml)，25μl 重组人IL-2(hrIL-2，80U/ml)和25μl重组鼠IFN-γ(mrIFN-γ，4000u/ml)，或100μl MLC培养上清；共同培养7d后，于每孔加入上述浓度的IL-2和IFN-γ各25μl，继续培养7d，直到阳性孔克隆细胞生长布满孔底的1/2。

3. Th2克隆诱导：将96孔板各孔加入50μl Th细胞悬液(≤2000/ml)，50μl经过照射的同系脾细胞(2×10⁶ /ml)，50μl抗原(200～1600μg/ml)，50μl hrIL-2(40u/ml)或50μl ConA诱生上清(40%)；共同培养7d后，于各孔加入上述浓度的IL-2或ConA诱生的上清，继续培养7d。

4. Th1和Th2克隆的传代培养：将24孔板各孔加入5×10⁴ ～2×10⁵ /100μl Th1或Th2克隆细胞，6×10⁶ /900μl经过照射的同系脾细胞，MLC培养上清500μl或hrIL-2 25U/ml和mrIFN-γ 250U/ml(Th1克隆)；ConA诱导上清(10%)或hrIL-2 25U/ml(Th2克隆)，总体积为1.5ml/孔。将培养板置37℃，5%CO₂ 温箱培养，7～10d传代一次，同样加入同系脾细胞和生长因子。

5. T细胞克隆化：可采用软琼脂培养和有限稀释法对上述各类克隆细胞进行单个细胞克隆及克隆化培养，在克隆化的同时均需加入生长因子。经克隆化的细胞检测其特性，如细胞毒活性，淋巴因子的分泌以及增殖反应等。