同种反应性Th和CTL克隆的制备

鼠T细胞克隆分为同种反应性T辅助细胞(Th)和细胞毒性T细胞(CTL)克隆，以及与可溶性蛋白抗原反应的Th1和Th2克隆。

同种反应性是指未免疫的鼠或人T细胞对同种异体细胞上组织相容性抗原的反应。尽管同种反应性T细胞克隆可从未免疫的脾细胞或淋巴细胞制备，但经同种抗原预刺激的细胞所获反应细胞的频率较高。细胞毒性和非细胞毒性T细胞可经有限稀释进行克隆。

材料与试剂

1. 同种反应性鼠脾T细胞；

2. 以2000rad照射的同种鼠脾细胞作为刺激细胞。

3. 细胞培养所需的试剂和设备

4. 条件培养液(条件液)的制备

除了重组淋巴因子可用于T细胞克隆外，各种类型的条件培养液均可作为T细胞克隆的生长因子(T cell growth factors， TCGF)。不同的条件培养液含有不同的淋巴因子。

ConA诱导的细胞培养上清含有大量的IL-2，但IL-4和IFN-γ的含量较低，而继发MLC培养上清含高水平IFN-γ，IL-2。PMA(TPA)激活的EL-4肿瘤细胞上清(EL-4上清)含IL-2。由此可根据不同的克隆选用不同的条件培养液。

① ConA诱导的细胞培养上清(ConA上清)：于24孔培养板孔中加入1.25×106/ml鼠脾细胞和2.5μg ConA，置37℃5%CO2 温箱培养24～48h，离心收集上清，以CTLL-2或HT-2细胞检测其IL-2含量，分装，置-70℃保存备用。

② 继发MLC培养上清：取C57BL/6鼠脾细胞2.5×107 (反应细胞)与等量经过照射(2000rad)的DBA/2鼠脾细胞(刺激细胞)在20ml培养液中混合，置37℃，5%CO2温箱培养10～14d，作为原代MLC。离心收集原代MLC细胞，用培养液洗1次。

取6×106 原代细胞与2.5×107 经过照射的脾细胞混合，同上述条件培养36h，收集培养上清，置-70℃保存备用。细胞作为以下试验用的继发MLC细胞。

③ EL-4上清的制备：于24孔板加入106 /ml EL-4鼠淋巴瘤细胞和20ng PMA，培养4h。收集细胞，以培养液洗3次，加入培养液后继续培养36h。收集上清，置-70℃保存备用。

操作步骤

1. 于96孔培养板孔中加入106 /100μl经过照射的同种脾细胞。

2. 取继发MLC细胞，用含ConA或MLC上清的培养液作有限稀释至1～10个细胞/ml，于步骤(1)板孔中加入50μl细胞悬液。培养4d后各孔加入50μl ConA或MLC上清和50μl培养液。继续培养7～10d。

3. 用51Cr释放试验测定细胞毒活性，以筛选同种反应CTL与Th。若细胞毒试验阴性，可以增殖试验测定Th活性。亦可通过IL-2、IL-4的产生或CD4、CD8的表达进行筛选。

4. 鉴定同种反应性T细胞的特征，如细胞毒活性、增殖反应或某些淋巴因子的分泌等。

5. 克隆细胞的维持:将2.5×104 ～1×105 细胞转种24孔培养板孔中，同时加入1×106 经过照射的同种脾细胞和含条件液的培养液，每周传代一次。