CTL反应

dna2：我研究重组MVA疫苗，构建了survivin和IL-2重组的MVA病毒，并用病毒感染的DC细胞刺激自体T细胞，进行Survivin特异性的杀伤实验。条件如下：

外周血分离单核细胞（体外诱导分化为DC）和T细胞为HLA-A2阳性

DC与T细胞1：10刺激一周后重复刺激，并补加IL-2，两周后进行杀伤反应

survivin特异性多肽预处理的T2作为靶细胞，非特异性多肽预处理的T2作为对照

效靶比为40：1，20：1，4：1 进行杀伤4-6小时

现在无法检测到特意性的杀伤，各组的靶细胞死亡率都相当并且很低（不超过30%），不知是什么原因，请教大家应该做如何的改动？

我们实验室没有条件做Cr51释放，我都是用CFSE-PI染色或PKH26-annexin V 检测靶细胞死亡。

另外，MVA感染的DC与T细胞共培养6-7天时，显微镜下观察和流式检测都发现T细胞有大部分死亡，状态很差。共培养两周后死亡率很高，不知是否正常？

感染的DC细胞应先刺激成熟，但不知是感染前刺激还是感染后刺激为好，也不知用什么刺激DC成熟。我用的TNF-a，但效果不好。是否一定要用TNF-a、IL-6、IL-1B、PEG2的cocktail吗？用LPS行不行？

望高手尽快给于帮助！谢谢，谢谢。

丁香园网友beyondjulian认为：

CTL反应的检测方法：

1>； Cr51释放实验：4-h释放实验、5-h释放实验为比较经典的实验，我们这里也存在相同的情况，无法获取方式性物质，无法完成检测；

2>；结晶紫染色法：

3>；MTT： 好似这种方法过于落伍，也不能被广泛接受；

4>；LDH：乳酸脱氢酶实验。已有较多的国内外文献应用此种方法，我的一个师弟正在做。用的是Promega的试剂盒，10块板才1500RMB左右。我以前看过Roche好似也有。

综合考虑：LDH法，不用想了，绝对没错。

预祝成功。