蛋白质组分析方法--肽质量指纹
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蛋白质组分析方法 -- 肽质量指纹
在大多数蛋白质组流程中，质谱主要用于分析较短的肽，而较少测量全长蛋白质的分子量。一般情况下，蛋白质样品都要用裂解试剂处理，如胰蛋白酶、凝乳蛋白酶、Lys-C、内蛋白酶V8或CNBr。因而会形成特定的肽，这些特定的肽会容易进行质谱测量。
对产生的肽进行质谱测量得到的结果是一个称为肽质量指纹(peptidemass fingerprint，PMF)的图谱(Henzel等，1993；James等，1993；Mann，Hoirup和Roepstorff， 1993；Pappin，JOjrup和Bleasby，1993；Yates等，1993)，这个结果还表明了产生的肽的质量和丰度。实验测量的质量数据输送至专门的PMF鉴定工具，后者能够展示包括蛋白质数据库序列在内的所有蛋白质的理论指纹，并能把这些理论肽指纹与实验测定的数据进行比较。这样的一个搜索结果是与实验数据以不同分值相匹配的一系列数据库蛋白质条目。最高分值对应的是可能的鉴定蛋白质条目。
PMF的工作原理和基于MS／MS的蛋白质鉴定过程
当前市场中提供快速和高分辨率MALDI-TOF仪器具备高通量性能，这种仪器几秒钟就能得到一张图谱，所以理论上1天能够处理几百个样品。但这个性能很少能够达到，因为处理步骤和确认步骤常达不到仪器的效率。PMF处理在有些情况下会显示出某方面效率的局限，而且有时候会给出模糊的结果，这些情况包括如下几个方面。
①当PMF需要在一个很大的序列数据库中搜索时。因为方法的特异性是基于统计学的，所以数据库越大，随机匹配上不要的蛋白质条目的机会越大。
②当蛋白质是翻译后被修饰或转录后被修饰的。m／z值主要用于匹配未修饰的肽，也就是说仅由20种天然氨基酸组成的肽。翻译后修饰改变了肽的质量，因而减少了某一蛋白质可能的匹配的质量值。与此类似的是，对于未注释的另类剪接、未考虑的处理事件和突变也能降低匹配数量，因而减低了蛋白质的分值。
③在极端蛋白质分子量(特别小或特别大)的情况下。很小的蛋白质只能产生很少数量的可以分析的肽，而且有可能这些肽并不都出现在图谱上。在这种情况下，必需的最低匹配肽的数目都不能达到。与此类似的是，鉴定一个蛋白质的一个碎片也是很困难的。在蛋白质很大(分子质量超过150kDa)的情况下，理论的肽数量太大，以至于其中有些肽可能随意地与每一张图谱都能够匹配上。
④当研究的蛋白质序列是目前蛋白质序列数据库所未知的序列时。这里有几种情况：a．随机的匹配都没有与高分值相关联的，没有得到有意义的命中目标，这就意味着鉴定是不成功的；b．有一个对应于同源蛋白质或相似蛋白质的蛋白质匹配，这时需要另外的知识，比如样品种属或组织以助于归类；c．有一个显示有意义分值的随机匹配，这时研究者需要根据样品另外的生物学知识来对命中目标的性质进行判别和鉴定。
⑤当切离的一个斑点包含几种蛋白质时。在这种情况下，图谱可能会很复杂，而且包含很多的信号。这时候会存在一个风险，即蛋白质得到的有意义的分值恰巧随机地与其他存在的蛋白质的m／z值相匹配(例如，如果有两个蛋白质A和B，分别匹配χ和y的m／z值，另外一个蛋白质C碰巧匹配A的某些χ值和B的某些y值，从而获得一个有意义的分值)。
