鉴定调控区的顺式作用元件
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鉴定调控区的顺式作用元件
研究反式作用因子之前，一般应先鉴定并分析调控区的顺式作用元件，因为与调控区发生功能性相互作用的蛋白质难以鉴定。只有在体内，与调控区相结合的蛋白质才能发生与其他所需蛋白质的协同作用，该蛋白质的真正功能才能表现出来。所以对于调控区内功能相关性的DNA元件分析，将有利于鉴定功能性相关的DNA结合蛋白，并可进一步说明与DNA相结合的转录因子对基因调控的重要性。对重要序列元件进行功能性验证的唯一方法是综合性突变分析。综合性突变分析包括缺失突变分析和置换突变分析，两者往往同时应用。
突变
分析的第一步是形成一系列5’缺失突变体并对其进行功能分析。通常是利用跨越所需缺失末端的正向引物和跨越转录起始位点的反向引物，通过PCR制备缺失突变体。两个引物都含有限制性酶切位点的序列，PCR产物经限制性内切酶切割后，可以插入进行同样酶切报道基因的载体，转染目的细胞，检测不同的5’缺失后报告基因的活性。每个突变体活性的数据以诱导后占野生型启动子活性的百分比表示。通过缺失突变分析可以初步确定功能性启动子的边界，但是还需要进一步利用置换突变分析，以鉴定重要的调控元件。
置换突变是利用一系列6―10bp置换突变体对功能性启动子区域进行扫描突变分析，从而鉴定边界内的各个调控元件。不能使用更小的突变体，因为有可能改变调控元件的排列，从而影响转录因子与该区域的结合。突变体应该足够的小，使重要调空元件能定位在相当精确的位置上。但也不能太小，因为将会需要更多的突变体，从而增加工作量。
在确定了调控元件后，可以利用更精确的3Lp缺失突变体，以确定调控元件的边界，并可以进一步确定该调控元件是代表一个蛋白质的结合位点，还是代表两个或多个蛋白质的结合位点。如果发现一个重要元件跨越5～10bp，该元件很可能与某一种蛋白质相互作用。如果元件跨越12―20bp或更长，它可能是一个混合元件。对于置换突变也有缺点，因为一种突变有可能会产生影响启动子活性的另一种蛋白质的结合位点。为了确定是否产生了另一种蛋白质结合位点，可以通过结合位点数据库检索方法进行分析，或者参阅其他相关文献的报道。在瞬时和稳定转染分析中可能会漏掉对于内源基因转录比较重要的调控元件。因为即使是稳定转染质粒也不能保证整合到那些与内源基因相同的染色质结构，所以可能会漏掉在基因活化或失活过程中对于染色质重建过程起重要作用的一部分调控元件。
在调控区中构建置换突变体也有多种方法可以使用，PCR法仍是最快速、普遍的方法，寡核苷酸指导的诱变也比较有效、快捷。
