体内噬菌体展示技术筛选肝癌组织特异性黏附肽材料与方法
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体内噬菌体展示技术筛选肝癌组织特异性黏附肽材料与方法
旨在利用体内噬菌体 展示技术，筛选与肝癌组织或细胞特异性亲和的短肽。一方面为临床研究肝癌的发生发展机制提供新的线索；另一方面，也可作为某种诊断、治疗制剂来影响和抑制肝癌细胞的繁殖和转移，减少肿瘤早期诊断的盲目性和治疗过程中抗癌药物对人体自身的损伤。最后由小分子多肽取代传统免疫毒素中抗体成分，大大降低传统单克隆抗体及其片段所造成的免疫原性，为肿瘤导向治疗研究开辟新的道路。
1．实验动物、噬菌体肽库和细胞株
实验用荷瘤裸鼠购自上海实验动物中心，噬菌体12肽文库及大肠杆菌ER2738购自美国NewEnglandBiolab公司，人源肝癌细胞BEL―7402、正常肝细胞HL―7702购自中国科学院上海生物化学及细胞生物学研究所细胞库。
2．试剂
RPMI―1640培养基购自美国GIBCO公司，小牛血清购自杭州四季青公司；PEG―8000购自美国Amresco公司，兔抗M13噬菌体血清由澳大利亚CSIRO动物健康研究所提供，羊抗兔酶标抗体购自美国SIGMA公司，其余试剂为国产分析纯。
3．细胞培养
人源肝癌细胞BEL―7402及正常肝细胞HL―7702常规培养在37~C、5％C02条件下，90％RPMI―1640培养基、10％小牛血清培养基中。
4．荷瘤裸鼠体内噬菌体的筛选
通过尾静脉注射将200ul(约1011 )的噬菌体引人荷瘤裸鼠血液循环系统，15～20min后乙醚麻醉并解剖，250ml生理盐水心脏灌流，洗脱未结合的噬菌体。灌流结束后取部分肿瘤以及肝脏组织称重，测噬菌体效价，计算单位组织中噬菌体含量。剩余组织用多聚甲醛固定后用于免疫组织化学鉴定。回收的噬菌体扩增后进入下一轮筛选，共筛选3轮。筛选结束后挑取噬菌体单克隆扩增，测序后进行序列同源性分析。
5．免疫组织化学方法鉴定体内筛选结果
3轮筛选过程中取下的裸鼠各主要器官，采用间接免疫酶组织化学法进行鉴定，观察各轮筛选过程中噬菌体肽在体内与肿瘤的特异性结合情况。冰冻状态下切片，冷丙酮固定，3％过氧化氢甲醇混合液室温处理，5％脱脂奶粉封阻，兔抗噬菌体M13抗体4℃孵育过夜，酶标二抗孵育2h。DAB显色，苏木精染色观察。
6．体外鉴定目标噬菌体单克隆
将等量(104 ／孔)的BEL―7402和L―02分别加入96孔细胞培养板中培养过夜，将100／11噬菌体单克隆(约1011 )分别与肝癌细胞和正常肝细胞反应，用免疫酶技术显色，酶标仪读取每个反应孔的A490nm ，值。按下列公式计算每个目标噬菌体肽的特异结合系数：
特异性结合系数=(与癌细胞反应A49 0 －相应野生型噬菌体A490 )÷(与肝细胞反应A49 0 －相应野生型噬菌体A490 )
7．体内鉴定目标单克隆的体内导向效果
结合细胞ELISA以及同源序列分析，我们选取A54号噬菌体单克隆进行体内的导向效果鉴定。尾静脉注射200ul(约1011 )噬菌体回输到裸鼠体内，心脏灌流后取部分正常及肝癌组织进行称重、测效价，剩余组织冷冻切片，用免疫组织化学观察。
