正常大兔骨间充质前体细胞的体外成软骨培养
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实验材料:
1. 实验动物:5月龄兔;
2. 清洗液:不含Ca2+ 和Mg2+ 的PBS,添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素,pH7.2;
3. 完全培养基:DMEM培养液,补充10%胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml
4. 化学限定性培养液:基础培养基为DMEM培养基,添加胰岛素6.25μg/ml、转铁蛋白6.25μg/ml、亚硒酸6.25μg/ml、亚油酸5.35μg/ml、牛血清白蛋白1.25μg/ml、丙酮酸盐1mmol/L、抗坏血酸-2-磷酸盐37.5μg/ml、地塞米松10-7 mol/L、TGF-beta;1 10ng/ml。另加青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml;
5. 离心管:15ml聚丙烯圆锥形离心管。
实验方法:
1. 在注射器中预先吸入3000U肝素,然后从兔髂骨嵴或胫骨抽吸7—8ml骨髓;
2. 将完全培养液加入取得的骨髓中,吹打分散细胞。计数有核细胞;
3. 在直径为10mm的培养皿中接种2×107 个有核细胞。于37℃、5%CO2 饱和湿度的CO2 培养箱中培养。培养物用完全培养液维持生长14d。每隔4d换液1次;
4. 培养至14d,用胰蛋白酶消化培养物,分散细胞。用完全培养液终止胰蛋白酶的作用,收集细胞。计数;
5. 以每份5×105 个细胞加到15ml聚丙烯圆锥形离心管中。离心(500g,10min)。弃上清液。注意不要分散细胞团块;
6. 往离心管小心加入化学限定性培养液,保持细胞团块结构。直接将离心管放到37℃、5%CO2 饱和湿度的CO2 培养箱中培养。每隔2—3d换液。