正常大兔骨间充质前体细胞的体外成软骨培养

实验材料：

1. 实验动物：5月龄兔；

2. 清洗液：不含Ca²⁺ 和Mg²⁺ 的PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素，pH7.2；

3. 完全培养基：DMEM培养液，补充10%胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml

4. 化学限定性培养液：基础培养基为DMEM培养基，添加胰岛素6.25μg/ml、转铁蛋白6.25μg/ml、亚硒酸6.25μg/ml、亚油酸5.35μg/ml、牛血清白蛋白1.25μg/ml、丙酮酸盐1mmol/L、抗坏血酸-2-磷酸盐37.5μg/ml、地塞米松10^-7 mol/L、TGF-beta;₁ 10ng/ml。另加青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml；

5. 离心管：15ml聚丙烯圆锥形离心管。

实验方法：

1. 在注射器中预先吸入3000U肝素，然后从兔髂骨嵴或胫骨抽吸7—8ml骨髓；

2. 将完全培养液加入取得的骨髓中，吹打分散细胞。计数有核细胞；

3. 在直径为10mm的培养皿中接种2×10⁷ 个有核细胞。于37℃、5%CO₂ 饱和湿度的CO₂ 培养箱中培养。培养物用完全培养液维持生长14d。每隔4d换液1次；

4. 培养至14d，用胰蛋白酶消化培养物，分散细胞。用完全培养液终止胰蛋白酶的作用，收集细胞。计数；

5. 以每份5×10⁵ 个细胞加到15ml聚丙烯圆锥形离心管中。离心（500g，10min）。弃上清液。注意不要分散细胞团块；

6. 往离心管小心加入化学限定性培养液，保持细胞团块结构。直接将离心管放到37℃、5%CO₂ 饱和湿度的CO₂ 培养箱中培养。每隔2—3d换液。