正常人骨间充质干细胞的培养

实验材料：

1. 骨髓来源：骨髓材料由健康人提供；

2. 清洗液：不含Ca²⁺ 和Mg²⁺ 的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100µg/ml链霉素，pH7.2；

3. 分离液：密度为1.073g/ml的Percoll溶液；

4. DMEM-LG培养液：含1000mg/L葡萄糖的DMEM培养液，补充10%胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100µg/ml；

5. 消化液：为0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA混合消化液；

实验方法：

1. 由临床医生抽取健康人骨髓。加肝素抗凝；

2. 取25ml肝素化骨髓与等体积的PBS混合，用吸管吹打分散细胞。在室温下离心（900g，10min）。弃上清液；

3. 加入PBS悬浮细胞，调节细胞密度至4×10⁷ 个/ml；

4. 在离心管中先加入1.073g/ml的Percoll溶液，再将5ml细胞悬液铺于其上。离心（900g，30min）；

5. 收集界面上的细胞，加入DMEM-LG培养液清洗。离心，收集细胞；

6. 用DMEM-LG培养液重新悬浮细胞，计数细胞，调节细胞密度；

7. 将细胞以1.6×10⁵ 个/cm² 的密度接种于培养瓶中。在37℃、5%CO₂ 饱和湿度的CO₂  培养箱中培养。48h后换液，以后每3—4d换液1次；

8. 当培养的细胞相互汇合达到90%的生长表面时，用0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA液消化分散细胞。进行继代培养。