子宫内膜间充质干细胞的分离和培养

人子宫内膜是一个高度再生的组织，这种巨大的再生能力被认为与人类子宫内膜干细胞有直接关系。子宫内膜干细胞分类较为多样化，包括子宫内膜细胞侧群（side population，SP）、子宫内膜间充质干细胞、月经血来源的干细胞等。子宫内膜间充质干细胞（enMSCs）是一类具有自我更新能力、分化潜力、低免疫原性、低致瘤性等生物学特性的新型成体干细胞。

分离的子宫内膜间充质干细胞可以临床治疗月经失调、子宫内膜疾病、不孕症、器官损伤。

DMEM/F12（1:1）培养基、胎牛血清

D-Hanks缓冲液、胶原酶III、DNase I

青链霉素

CD29、CD45、CD90、CD34、CD73 和 CD133 抗体

2.5% 胰蛋白酶

一、子宫内膜间充质细胞的分离与培养

1、手术切取子宫内膜全层和子宫肌层（5 mm）迅速放入装有 0 ℃ D-Hanks 的无菌瓶中。

2、在超净台内，用无菌 D-Hanks（含青链霉素）洗涤 2 次，去除表面血液等杂物。

3、充分洗干净后，用眼科剪将其剪碎至大小约 1 mm³ 左右。之后迅速将组织置入装有 300 mg/mL 胶原酶III 和 40 mg/mL DNase I 的 15 mL 离心管中，在此过程中保持组织始终浸泡于消化酶中。

4、37 ℃ 震荡消化 45 min，在此过程中间断利用移液器向离心管底部轻轻吹打气泡（以保持连续冒出气泡为宜）。

5、小心吸取消化液，保留组织碎块，消化液经 200 目的滤网过滤，消化好的单个细胞形成滤液。

6、1000 r/min 离心步骤（5）中所得的消化液 10 min，弃去上清。

7、0 ℃ D-Hanks 洗涤细胞 2 次。

8、加入 DMEM-F12 培养基（含 10% 胎牛血清），在 37 ℃，含 5% CO₂ 培养箱中培养。

9、首次换液时间为培养的 4~5 d，可去除大部分未贴壁细胞及残留的红细胞，并观察细胞的形态、排列方式，拍照。期间 2~3 d 换液 1 次，待细胞融合达到 80% 左右时，按 1:1~1:2 比例用 2.5% 胰蛋白酶进行消化、传代。

10、经 2~3 代的传代培养纯化，分离得到纯度较高的人子宫内膜间充质干细胞。第 3~6 代的细胞可以进行后续实验。

二、子宫内膜间充质干细胞的鉴定

1、选取生长状态良好的细胞集落，离心收集细胞，弃上清，用 D.Hanks 液洗涤细胞两次，制成浓度为 1×10⁶ L-1 单细胞悬液，分别加入 10 μL 的 CD29、CD45、CD90、CD34、CD73 和 CD133 抗体，4 ℃ 避光孵育 30 min。

2、孵育完成后用 D.Hanks 液洗涤细胞两次，去除未结合的抗体，最后用 500 μL D.Hanks 液重悬细胞，用流式细胞仪检测 CD29、CD45、CD90、CD34、CD73 和 CDl33 的表达率。结果显示 CD29、CD90、CD73 阳性，CD34、CD45、CD133 阴性。

（1）采用无菌操作，避免细胞污染和外源性微生物感染。

（2）组织处理需要快速、准确、轻柔，避免细胞死亡或受损。

（3）组织消化时间需要严格控制，过短或过长都可能影响细胞分离和培养。

（4）细胞培养条件需要严格控制，保持良好的培养环境，包括温度、湿度、营养液浓度等。

（5）需要对子宫内膜间充质干细胞的纯度和质量进行鉴定，以确保其应用效果和安全性。

（6）细胞保存应采用合适的方法，保证其长期保存和使用。

（1）细胞分离效果不理想：可能是组织消化时间过短或过长，或者组织处理不当，需要注意操作规范和技巧。

（2）细胞培养效果不理想：可能是培养环境不适宜，如温度、湿度、营养液浓度等，需要调整培养条件。

（3）细胞生长缓慢：可能是细胞密度过低，或者细胞质量不好，需要注意细胞密度和质量的控制。

（4）细胞污染：可能是操作不严格，或者培养环境污染，需要注意无菌操作和环境卫生。

（5）细胞死亡：可能是组织处理不当，或者培养环境不适宜，需要注意操作规范和调整培养条件。

（6）细胞鉴定不准确：可能是鉴定方法不准确，或者细胞质量不好，需要注意鉴定方法和细胞质量控制。

（7）细胞保存不当：可能是保存条件不适宜，如温度、湿度、保存容器等，需要注意保存条件。