小鼠间充质干细胞培养
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一、细胞复苏和接种
1. 37℃预热小鼠间充质干细胞培养液和基础培养液。
2. 从液氮中取出细胞产品管，快速将其置入37℃水浴中解冻，直到管中只剩下最后一片结晶（注意：不要让水没过产品管）。
3. 在生物安全柜中，用75%的酒精擦拭产品管外壁。
4. 将产品管中的细胞移至15ml无菌离心管中，慢慢逐滴加入预温的37℃基础培养液4－5 ml混匀，边滴加边摇匀。
5. 用1ml基础培养液冲洗产品管，并将其转移到15 ml离心管中，边滴加边摇匀。
6. 轻轻混匀细胞后，取10 μl细胞悬液和10 μl台盼蓝混匀，从中取10 μl计数。这一步骤非常重要，能确定您收到的产品是否合格（详见如何计数复苏的细胞）
7. 细胞悬液在1 000 rpm，室温条件下，离心5分钟，去除上清。
8. 加完全培养液4－5 ml，调整细胞量，轻轻混匀细胞，备用。
9. 按10 000-15 000个细胞/cm2接种细胞。
10. 每个T25培养瓶中加完全培养液3-5 ml， 后置于37℃、5%CO2 培养箱内培养。
二、细胞换液和培养
注意：复苏或传代后的细胞，请于24小时后，第一次更换培养液。
1. 复苏后的细胞经37℃、5%CO2 培养箱内培养24小时，此时细胞已完全贴壁，更换培养液后，请继续在37℃，5％CO2培养箱内培养。
2. 之后，每2-3天更换培养液1次，至细胞长到培养瓶表面的80% 可进行传代或冻存。
3. 换液前，请将培养液从4℃中取出，使其恢复到室温。
三、消化细胞
1．消化液的配制：pH7.0-7.2 ，分别配制0.5%胰酶液和0.04%EDTA-Na2液，
用前按1：1混合。
将PBS或D-Hank's液, 消化液，含10% FBS的基础培养液恢复到室温。
2．具体操作如下：
（1）吸去培养液，加入3 ml PBS或D-Hank's液，使PBS或D-Hank's液均匀的分布在培养瓶细胞表面。1分钟之后，吸去PBS或D-Hank's液。
（2）每个T25培养瓶加入消化液2 ml，使消化液均匀的分布在培养瓶细胞面。
（3）25℃消化2分钟，在显微镜下看细胞回缩成圆形后，轻轻震动使绝大部分细胞脱落。
（4）向每个培养瓶中加3-5 ml 含10% FBS的基础培养液中和胰酶的消化作用。
（5）用移液管轻轻吹打培养瓶表面使细胞完全脱落后，吸至15 ml无菌离心管内。
（6）20℃，1 500 rpm 离心5分钟，弃上清。
（7）加入一定量的完全培养液，调整细胞数量后，抽样加入胎盘蓝计数，得到细胞数和活性后，按细胞数传代或冻存。
四、细胞传代
1．消化细胞（详见第三步）。
2．按10000-15000个细胞/cm2接种细胞于T25的培养瓶中。
3．每个培养瓶中加完全培养液3-5ml，后置于37℃、5%CO2 培养箱内培养。
五、细胞冻存
1．调整细胞数5×105 /ml，加入一定量的基础培养液。之后，配制等量的冷冻保护剂。
2．冷冻保护剂的配制：FBS占80%，DMSO占20%。
3．将细胞悬液于冰浴中，慢慢逐滴加入冷冻保护剂，边滴加边摇动，加完后用轻轻吹打混匀。
4．在冰浴中，将细胞分装于冻存管中，每管1 ml或1.8 ml。
5．将冻存管置于冻存盒内，放入-80℃冰箱中，24小时后转入液氮中保存。
