骨髓间充质干细胞(MSC)原代培养与传代培养

准备工作

（1）试管、试管架、滴管、吸管、小鼠固定架、玻璃瓶、玻璃皿、烧杯、橡皮头、剪刀、镊子、纱布、棉球、酒精灯、滴管、移液器、细胞计数器、生理盐水、PBS、双抗（青链霉素）、75%酒精、95%酒精、培养瓶（50ml，260ml）。

（2）BALB/C小鼠（4~5周龄，18~22g，雌雄不限）、胎牛血清（灭活）、DMEM-LG培养液（美国GIBCO）

（3）针头与注射器：4.5号、7号针头（冲小鼠股骨、胫骨和肱骨骨髓，制单细胞悬液）。

实验前准备

（1）实验室消毒，隔离衣消毒，小鼠固定架消毒。配10%FBS培养液，加双抗（内含青霉素、链霉素各100μg/ml）。

（2）用75% 酒精擦拭无菌操作台面，取各种已消毒的培养用品置于超净台面，无菌室及超净台用紫外灯照射30~60 分钟灭菌。

（3）开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。穿隔离衣，戴手套。用70% 酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10 分钟后，才可开始实验操作。点燃酒精灯，安装吸管帽。

实验步骤

（1）BALB/C纯系小鼠脱臼处死后，75%乙醇浸泡5min后，在无菌操作台上无菌条件下分离双侧股骨及胫骨，在含生理盐水的50mm2玻璃平皿中去除股骨周围肌肉组织，剪去包括骺板在内的两侧骺端，用10ml注射器（配4.5号针头）抽取适量含10%FBS的完全培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养瓶。依次用7号针头和4.5号针头（或依次过21、23、25号）反复吹打骨髓细胞悬液，制成单细胞悬液。细胞悬液在1000rpm离心5min后收集细胞或进行密度梯度离心。

（2）将单细胞悬液于1:2比例加到含1.082比重Percoll细胞分离液的离心管中，4℃条件下，经500g密度梯度离心25min，小心收集离心液界面上乳白色云雾状的单核细胞层，加入等量无血清培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）充分洗涤（500g离心5min或180g离心10min）2次，去上清，用10%FBS的培养基悬浮细胞（用0.83%氯化胺破碎红细胞，培养液重悬细胞）。注意：密度梯度离心力500g×30min组优于800g×30min。本步骤可以省略。

附：人骨髓：抽取骨髓10-15ml（或正常人手术肋骨取骨髓3-5ml），每毫升骨髓加100u 肝素抗凝，充分混匀后，保存于4℃冰箱，24小时内分离骨髓MNC。骨髓先加入等量 PBS或Hanks液（或培养液）混匀后，以1份淋巴细胞分离液上面加2份稀释骨髓的比例，将稀释骨髓缓慢加入ficoll液面上（密度1.077），水平离心机20℃条件下500g（2000r/min）离心25~30分钟。从界面上取出的MNC用PBS液洗涤2~3次后，加适量培养液计数。

（3）数细胞数量，达到106~107/ml后即进行原代培养，按5×106/ml浓度接种于50ml培养瓶中（1×106/cm2培养瓶），每瓶含5ml L-DMEM完全培养液。在体积分数为5%的CO2和37℃条件下静止培养，3d后换液去除非贴壁细胞，以后每3~4d半量换液1次，10~12d细胞达90%融合时传代。

（4）传代培养：传代时先全部吸出培养液后，用无Ca2+ 、Mg2+PBS液洗涤二次，加入37℃预热的0.25%（2.5g/L，0.25%）胰蛋白酶（含1mmol/L EDTA，即用1mmol/L-EDTA-Na2配制）消化1~2分钟，吸去胰酶，以残留的胰酶继续消化，倒置显微镜下观察，细胞开始皱缩时（细胞开始变圆）加入完全培养液（3ml左右）终止胰酶作用。吸管反复吹打后将细胞收集于15ml离心管中，1500r/min 离心10分钟后弃上清，再用PBS液洗涤二次彻底洗去混有的胰蛋白酶。

将细胞再悬浮于培养液中，按2~5×105/ml再次接种传代于新的培养瓶中。当这些细胞生长接近融合层时，即得到骨髓MSC。传至3~5代的MSC按1×105cells/cm2密度接种于放置有盖玻片的6孔板内，以制备细胞爬片。

注：贴壁细胞的消化，应掌握各类型细胞不同的消化时间，避免过度消化，损伤细胞活力；或消化不足，不能充分解离成单细胞。如为长期实验，每个月重新复苏一支细胞，避免长期传代引起细胞特性变异。