简介
胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）是指从桑椹胚或附植前囊胚内细胞团分离的一种多能性干细胞，是最经典的多能性干细胞，它位于个体发育的顶端，具有发育的全能性，能够分化为组成机体的所有类型的细胞，进而形成机体的任何组织和器官，并具发育成完整个体的能力。
材料与仪器
器材：
① 无菌手术器械
② 显微镜
③ 注射器
④ 培养箱、培养皿
试剂：
① 鼠
② L-谷氨酰胺（2 mmol/L），青霉素（100 U/ml）链霉素（100 μg/ml）（Gibeo），抑制素（1 ml）
③ MEF 培养基培养液、DMEM/F12（500 ml），Neurobasal（500 ml），N2（5 ml），B-27（10 ml），2% 胎牛血清 BSA（1.25 ml）
④ PBS、麻醉剂、以 70% 乙醇等
⑤ β-巯基乙醇（1 ml）
⑥ PD0325901（25 μl），CHIR99021（60 μl），白血病抑制因子 LIF（100 μl）
步骤
大鼠 ES 细胞的体外培养的基本操作为：
（一）复苏细胞
从液氮中取出一管细胞；将冻存管置于 37 ℃ 水浴中轻轻晃动，直到管内溶液恰好完全溶解；防止结晶的形成对细胞造成损害。将细胞转移到 15 ml Falcon 管中；加入 5 ml ES 培养基（用培养基冲洗冻存管）；离心 3 分钟；弃上清，用 2 ml ES 培养基重悬细胞，至少吹打 10 次；接种在明胶包被的培养皿中（无 feeder 培养）；或铺在事先铺好 feeder 细胞的培养皿中（有 feeder 培养）。
（二）冻存细胞
1 x PBS 洗细胞并留少许 PBS 在培养皿内；用细胞刮刀收集细胞；将细胞转入 15 ml Falcon 管内并离心 3 分钟；弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液（90％ FBS 和 10％ 二甲亚砜）中。分装于冻存管内，每管 1 ml；冻存管放在冻存盒中，置于-80℃ 过夜，第二天移入液氮。
（三）细胞传代
每 2～3 天传代细胞一次，过度生长会导致细胞分化，将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。去除培养液，PBS 洗一次；加入胰酶或 TryPLe 37 ℃ 孵育 3 分钟，消化细胞。然后加入等体积的培养基。将细胞转移至 15 ml 离心管中离心，去除上清，将细胞重悬于 2 ml ES 培养基，至少吹打 10～20 次。将细胞接种在没有包被的组织培养皿中放入温箱 2 小时，分化细胞在该时间内将黏附，而 ES 细胞仍将保持悬浮；将含有细胞的培养基转入明胶包被或 feeder 包被的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开。按 1:4～1:10 的比率传代，37 ℃，5％ CO2 培养。
来源：丁香实验
