正常骨内成骨细胞原代培养

实验材料：

1. 骨组织来源：新生或胚胎大鼠、兔、人类胚胎或手术切除之骨组织；

2. 清洗液：不含Ca²⁺ 和Mg²⁺ 的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素，pH7.2；

3. 消化液：0.25%胰蛋白酶溶液，1mg/mlⅡ型胶原酶溶液；

4. 培养液：RPMI 1640培养基，配制培养液时加入15%的小牛血清，并用5.6% NaHCO₃ 调节至pH 7.2。

实验方法：

1. 取生后1—2d大鼠若干只，拉颈处死后投入盛有75%乙醇的容器内消毒3—5min。取出置于消毒培养皿中；

2. 用手术剪剪开头顶部皮肤，取颅盖骨（扁骨），放入盛有缓冲液的培养皿中。去除骨膜及周围结缔组织，再用缓冲液洗2次；

3. 将洗好的颅盖骨片置于含少量小牛血清的培养皿中剪碎成1mm×1mm大小的骨片植块；

4. 将骨片植块直接接种于25ml螺旋口培养瓶内。也可在接种前，先用1mg/mlⅡ型胶原酶溶液消化植块15—20min，经缓冲液清洗2次以除去消化液，加少量小牛血清于培养皿内，再将侵于小牛血清中的骨片植块接种于培养瓶内。为了便于细胞鉴定，可在接种时将消毒盖玻片条置于植块周围；

5. 反转培养瓶，使种植有植块的一面朝上。加入3ml左右的培养液，盖好螺旋盖，但不拧得过紧，以利于与外界进行气体交换。将培养瓶置于37℃、5%CO₂ 、饱和湿度的CO₂  培养箱中培养；

6. 2h后，植块黏附较为牢固，此时轻轻翻转培养瓶，使组织块浸没于培养瓶中，继续培养。间隔3d换液一次。