原理
采用植块培养方法时，用少量培养液孵育，使骨组织块贴附于培养瓶。骨组织块浮起后观察细胞长出情况。采用分离细胞的单层培养方法时，将松质骨切成 2~5 mm 大小，用胶原蛋白酶和胰蛋白酶消化。将混悬的细胞接种于培养瓶，用 F12 培养液培养。
材料与仪器
骨标本
Hams F12 培养液 用于细胞传代的胰蛋白酶液 分离成骨细胞的消化液
Petri培养皿 培养瓶 手术刀 手术镊
Hams F12 培养液 用于细胞传代的胰蛋白酶液 分离成骨细胞的消化液
Petri培养皿 培养瓶 手术刀 手术镊
步骤
一、外植块培养
1. 从手术室获得骨标本。
2. 在室温条件下，用无菌生理盐水浸洗骨组织数次。
3. 如果骨组织不能及时使用，将骨标本放入含有 12% FBS、青霉素和硫酸链霉素的 Ham’s F12 （添加 12 % FBS、2.3 mmol/L Mg2＋、100 U/ml 青霉素和 100 ug/ml 硫酸链霉素）培养液中。骨标本可在 4℃条件下储存过夜。
4 . 次日早晨，用含有 100 U/ml 青霉素和 100 ug/ml 硫酸链霉素的 Tyrode 液浸洗骨组织。
5. 将骨组织放入 Petri 培养皿，用手术刀和手术镊取骨小梁，然后将骨小梁移入另一个 Petri 培养皿。
6. 加入 10 ml Tymde 液，淹盖切除的骨小梁。用 Tyrode 液浸洗骨小梁数次，直至除去血液和脂肪细胞。
7. 为了进行植块培养，将 2 ml 完全培养液放入 25 cm2 培养瓶，预孵育 20 min，以便用培养箱内的气体平衡培养液。根据需要，用 CO2、4.5% NaHCO3 或 HCl 调整 pH 。
8. 将骨小梁切成 1~3 mm 小块。
9. 吸去培养瓶内的预孵育培养液，然后加入 2.5 ml 新鲜的 Ham's F12培养液。
10. 将 25~40 块骨小梁放入培养瓶。
11. 将培养瓶直立，用接种环沿着培养瓶底壁滑动植块，使植块均匀分布。
12. 在 37℃条件下，将培养瓶直立放置 15 min。
13. 慢慢地使培养瓶恢复为正常的横置位。植块黏附于培养瓶底壁。
14. 在37℃ 条件下，将培养瓶横置 5~7 d。此后，检査细胞长出情况，换培养液。为了预防植块脱离，在将培养瓶从培养箱移于超净工作台内或显微镜上之前，将培养瓶慢慢地直立起来。
15. 每周换培养液 2 次，以维持培养。
16. 细胞生长形成单层时，取出植块，用胰蛋白酶（将 125 mg 胰蛋白酶（XI型，Sigma）溶入 50 ml 不含 Ca2＋ 和 Mg2＋ 的 Tyrode 液。调整 pH 至 7.0，过滤除菌。用 Pyrex 管分装成 5 ml 和 10 ml，在 -20℃ 条件下储藏）消化细胞。通过离心分离细胞，然后将细胞接种于培养瓶或培养皿。
二、分离细胞的单层培养
1. 用 Tymde 液反复冲洗松质骨，洗去脂肪和血细胞。在无菌条件下，用手术刀和手术镊切除骨小梁。
2. 取到较多的骨小梁后，用 Tyrode 液浸洗 3 次，洗去遗留的血液和脂肪细胞。将骨小梁切成 2~5 mm 小块。
3. 用含有 FCS 的 F12 培养液洗骨小梁块。
4. 将组织块放人盛有磁力搅拌棒的无菌小瓶内，然后加入 4 ml 消化液（分离成骨细胞的消化液：① A 液：含有 8.0 g NaCl、0.2 g KCl 和 0.05 g NaH2PO4 H2O，用 100 ml 超纯水配制。②B 液（胶原蛋白酶和胰蛋白酶混合液）：将 137 mg 胶原蛋白酶（Ⅰ 型，Worthington Biochemicals）和 50 mg 胰蛋白酶（Ⅲ，Sigma）溶入 10 ml A 液。调整 pH 至 7.2，然后用超纯水配成 100 ml。过滤除菌后，分装成 10 ml，在 -20℃ 条件下储藏）。加入的消化液应淹盖组织块。
5. 在室温条件下，将含有组织块的液体搅拌 45 min。
6. 弃去细胞悬液，因为这些细胞中很可能含有成纤维细胞。
7. 加入 4 ml 消化液，在室温条件下搅拌 30 min。
8. 收集消化液，在室温条件下离心（580 g，2 min）。
9. 吸去上清液后，用 4 ml 含有 20 % FCS 的 Ham F12培养液混悬细胞，计数细胞。
10. 将细胞悬液离心（580 g，10 min）后，用 4 ml 完全培养液混悬细胞。将此细胞悬液作为接种物。
11. 将 75 cm2 培养瓶用 8 ml 完全 F12 培养液预孵育 20 min，以便用培养箱内的气体平衡培养液。
12. 吸去预孵育培养液，然后加入 2 ml 完全F12培养液。
13. 加入 4 ml 细胞悬液，接种密度为 6000~10000 个/cm2。
14. 最后加入 6 ml F12培养液，使总量成为 12 ml。
15. 在分离细胞期间，向剩余的骨组织块加入 4 ml 消化液，重复消化 30 min 。
收集分离下来的细胞。如有必要，重复消化几次。骨组织多时，消化时间可延长至 1~3 h 。每次消化后计数细胞，将分离的细胞分别接种于培养瓶。
细胞传代
1. 取出植入的组织块。
2. 吸去培养液，用 D-PBSA （0.2 ml/cm2）浸洗细胞。
3. 向培养瓶加入胰蛋白酶液（0.1 ml/cm2），在 37℃ 条件下孵育，直至细胞脱离瓶壁，且细胞彼此分离。用显微镜观察细胞的脱离和分离。一般孵育 10 min 即可。
4. 将分离的细胞移入离心管，然后加入等量含有 20% FCS 的 Ham F12 培养液。
5. 离心（600 g，5 min）。
6 . 吸去上清液，用完全培养液轻轻混悬细胞，反复吹打。
7 . 留两份细胞份用于确定细胞密度，另一份用于 DNA 检测。
8. 将剩余的细胞接种于先前用培养液平衡的培养瓶或培养皿。细胞可在 24 h 内贴壁。
1. 从手术室获得骨标本。
2. 在室温条件下，用无菌生理盐水浸洗骨组织数次。
3. 如果骨组织不能及时使用，将骨标本放入含有 12% FBS、青霉素和硫酸链霉素的 Ham’s F12 （添加 12 % FBS、2.3 mmol/L Mg2＋、100 U/ml 青霉素和 100 ug/ml 硫酸链霉素）培养液中。骨标本可在 4℃条件下储存过夜。
4 . 次日早晨，用含有 100 U/ml 青霉素和 100 ug/ml 硫酸链霉素的 Tyrode 液浸洗骨组织。
5. 将骨组织放入 Petri 培养皿，用手术刀和手术镊取骨小梁，然后将骨小梁移入另一个 Petri 培养皿。
6. 加入 10 ml Tymde 液，淹盖切除的骨小梁。用 Tyrode 液浸洗骨小梁数次，直至除去血液和脂肪细胞。
7. 为了进行植块培养，将 2 ml 完全培养液放入 25 cm2 培养瓶，预孵育 20 min，以便用培养箱内的气体平衡培养液。根据需要，用 CO2、4.5% NaHCO3 或 HCl 调整 pH 。
8. 将骨小梁切成 1~3 mm 小块。
9. 吸去培养瓶内的预孵育培养液，然后加入 2.5 ml 新鲜的 Ham's F12培养液。
10. 将 25~40 块骨小梁放入培养瓶。
11. 将培养瓶直立，用接种环沿着培养瓶底壁滑动植块，使植块均匀分布。
12. 在 37℃条件下，将培养瓶直立放置 15 min。
13. 慢慢地使培养瓶恢复为正常的横置位。植块黏附于培养瓶底壁。
14. 在37℃ 条件下，将培养瓶横置 5~7 d。此后，检査细胞长出情况，换培养液。为了预防植块脱离，在将培养瓶从培养箱移于超净工作台内或显微镜上之前，将培养瓶慢慢地直立起来。
15. 每周换培养液 2 次，以维持培养。
16. 细胞生长形成单层时，取出植块，用胰蛋白酶（将 125 mg 胰蛋白酶（XI型，Sigma）溶入 50 ml 不含 Ca2＋ 和 Mg2＋ 的 Tyrode 液。调整 pH 至 7.0，过滤除菌。用 Pyrex 管分装成 5 ml 和 10 ml，在 -20℃ 条件下储藏）消化细胞。通过离心分离细胞，然后将细胞接种于培养瓶或培养皿。
二、分离细胞的单层培养
1. 用 Tymde 液反复冲洗松质骨，洗去脂肪和血细胞。在无菌条件下，用手术刀和手术镊切除骨小梁。
2. 取到较多的骨小梁后，用 Tyrode 液浸洗 3 次，洗去遗留的血液和脂肪细胞。将骨小梁切成 2~5 mm 小块。
3. 用含有 FCS 的 F12 培养液洗骨小梁块。
4. 将组织块放人盛有磁力搅拌棒的无菌小瓶内，然后加入 4 ml 消化液（分离成骨细胞的消化液：① A 液：含有 8.0 g NaCl、0.2 g KCl 和 0.05 g NaH2PO4 H2O，用 100 ml 超纯水配制。②B 液（胶原蛋白酶和胰蛋白酶混合液）：将 137 mg 胶原蛋白酶（Ⅰ 型，Worthington Biochemicals）和 50 mg 胰蛋白酶（Ⅲ，Sigma）溶入 10 ml A 液。调整 pH 至 7.2，然后用超纯水配成 100 ml。过滤除菌后，分装成 10 ml，在 -20℃ 条件下储藏）。加入的消化液应淹盖组织块。
5. 在室温条件下，将含有组织块的液体搅拌 45 min。
6. 弃去细胞悬液，因为这些细胞中很可能含有成纤维细胞。
7. 加入 4 ml 消化液，在室温条件下搅拌 30 min。
8. 收集消化液，在室温条件下离心（580 g，2 min）。
9. 吸去上清液后，用 4 ml 含有 20 % FCS 的 Ham F12培养液混悬细胞，计数细胞。
10. 将细胞悬液离心（580 g，10 min）后，用 4 ml 完全培养液混悬细胞。将此细胞悬液作为接种物。
11. 将 75 cm2 培养瓶用 8 ml 完全 F12 培养液预孵育 20 min，以便用培养箱内的气体平衡培养液。
12. 吸去预孵育培养液，然后加入 2 ml 完全F12培养液。
13. 加入 4 ml 细胞悬液，接种密度为 6000~10000 个/cm2。
14. 最后加入 6 ml F12培养液，使总量成为 12 ml。
15. 在分离细胞期间，向剩余的骨组织块加入 4 ml 消化液，重复消化 30 min 。
收集分离下来的细胞。如有必要，重复消化几次。骨组织多时，消化时间可延长至 1~3 h 。每次消化后计数细胞，将分离的细胞分别接种于培养瓶。
细胞传代
1. 取出植入的组织块。
2. 吸去培养液，用 D-PBSA （0.2 ml/cm2）浸洗细胞。
3. 向培养瓶加入胰蛋白酶液（0.1 ml/cm2），在 37℃ 条件下孵育，直至细胞脱离瓶壁，且细胞彼此分离。用显微镜观察细胞的脱离和分离。一般孵育 10 min 即可。
4. 将分离的细胞移入离心管，然后加入等量含有 20% FCS 的 Ham F12 培养液。
5. 离心（600 g，5 min）。
6 . 吸去上清液，用完全培养液轻轻混悬细胞，反复吹打。
7 . 留两份细胞份用于确定细胞密度，另一份用于 DNA 检测。
8. 将剩余的细胞接种于先前用培养液平衡的培养瓶或培养皿。细胞可在 24 h 内贴壁。
注意事项
1、实验材料要新鲜，从活体分离材料后要低温保存，并尽快进行细胞分离实验。
2、无菌操作。操作时用的培养液，可加平时细胞培养液5倍含量的青链霉素。
3、用酶法分离细胞时，注意酶液的浓度和控制消化时间。
贴块法分离细胞时，注意动作要轻柔，不要伤到细胞组织，组织块边缘尽量平整有利于细胞游离。
4、培养液的选择。不同的细胞有对培养液中营养的要求不同，根据所分离细胞的特性选择。
来源：丁香实验
