PriCells: 从人关节软骨中分离软骨祖细胞

试剂和材料：

1. 骨关节炎患者行膝盖关节半切开手术时未累及的部分；

2. 链霉蛋白酶消化培养基：DMEM/F12（1：1）、5%的FBS、抗坏血酸 50μg/ml、葡萄糖 1mg/ml、庆大霉素（50mg/ml），0.2%（终浓度100μg/ml）、链霉蛋白酶 70U/ml、HEPES 10mmol/L；

3. 胶原酶消化培养基：DMEM/F12（1：1）、5%的FBS、抗坏血酸 50μg/ml、葡萄糖 1mg/ml、庆大霉素（50mg/ml），0.2%（终浓度100μg/ml）、Ⅰ型胶原酶 300U/ml、HEPES 10mmol/L；

4. 胰蛋白酶/EDTA：胰蛋白酶（0.05%）和EDTA（0.53mmol/L）PBSA配制；

5. PBSC：含1mmol/L CaCl2，1mmol/L MgCl2的Dulbecco′s磷酸盐缓冲液；

6. PBSA：无Ca2+,Mg2+的Dulbecco′s磷酸盐缓冲液；

7. 胎牛血清；

8. 牛血清白蛋白（BSA），10μg/ml和1mg/ml，PBSC配制；

9. 血清纤连蛋白，10μg/ml，PBSC配制；

10. 尼龙膜，40μm筛网；

11. 普通器皿，30ml，或离心管50ml，带圆锥底部便于细胞离心；

12. 解剖刀片，10号；

13. 解剖刀柄，3号；

14. 镊子，2对（1大1小）；

15. 矿油凝胶（凡士林）；

16. 克隆杯，6mm；

17. 分离软骨用的锁子甲手套；

实验方法：

1. 组织收集和细胞分离；

（1） 无菌条件下，用10号解剖刀片小心从软骨下骨下面解剖软骨。将软骨薄片置于含PBSA的9cm Petri培养皿中；

（2） 用镊子和刀片仔细将软骨切成1mm3小块；

（3） 将软骨小块转移至含18ml链酶蛋白消化培养基的普通器皿或离心管中；

（4） 置于滚转机37℃处理1h；

（5） 吸出消化液弃之；

（6） 加入18ml胶原酶消化培养基，再次置于滚转机37℃处理1h；

（7） 40μm细胞滤网过滤；

（8） 用血细胞计数板进行细胞计数；

（9） 加入黏附测定培养基，620g离心10min进行洗涤，用黏附培养基以2000个细胞/ml密度重悬细胞（4000个细胞）；

2. 差异黏附测定；

（1） 用10μg/ml纤连蛋白包被3.5cm Petri培养皿，4℃过夜。阴性对照使用10μg/ml BSA；

（2） 吸出液体，用含1mg/ml BSA的PBSC封闭培养皿30min；

（3） 加入2ml培养基重悬的细胞悬液静置20min；

（4） 吸出培养基和未贴壁细胞，置于第二个培养皿中20min；

（5） 向第一个培养皿中加入2ml生长培养基后置于孵箱；

（6） 从第二个培养皿中吸出培养基和未贴壁细胞至第三个培养皿中；

（7） 向第二个培养皿中加入2ml生长配演技后置于孵箱；

（8） 向最后一个培养皿中加入200μl FBS后置于孵箱；

（9） 3h后，用相差显微镜计数最初贴壁的细胞；

（10） 培养细胞，至明显可见多于32个细胞的集落，一般需要10天；

3. 集落扩增；

（1） 用相差显微镜鉴定多于32个细胞的细胞集落，在培养皿下用记号笔将其画圈标记；

（2） 计数和记录每个集落的细胞数量；

（3） 从Petri培养皿中吸出培养基，用PBSA润洗；

（4） 在克隆环上无菌涂抹凡士林，或者使用无菌镊子直接将其浸入凡士林；

（5） 将克隆环置于集落上，向圈中加入胰蛋白酶/EDTA溶液，静置5—10min——相差显微镜观察细胞已脱落；

（6） 重悬细胞，置于Eppendorf管中，300g离心5min；

（7） 生长培养基洗涤，重复上述离心；

（8） 生长培养基稀释，12孔板中每孔接种1个集落；

（9） 细胞汇合时，接种至3.5cm培养皿（或6孔板），然后再移至较大培养瓶；