PriCells: 人软骨细胞的分化
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试剂和材料:
1. 分化培养基:DMEM/F12(1:1)、1%ITS(胰岛素、转铁蛋白、硒;V/V)、TGF-β1 1ng/ml、HEPES 10mmol/L;
2. 胰蛋白酶/EDTA:胰蛋白酶(0.05%)和EDTA(0.53mmol/L)PBSA配制;
3. PBSA:无Ca2+,Mg2+的Dulbecco′s磷酸盐缓冲液;
4. 离心管,15ml;
5. 普通器皿,30ml,或圆锥底的离心管(50ml);
实验方法:
1. 从培养瓶中吸出生长培养基弃之;
2. PBSA润洗后弃之洗液;
3. 加入足量的胰蛋白酶/EDTA覆盖培养瓶底;
4. 在37℃孵育5—10min(在显微镜下观察细胞是否脱落);
5. 重悬细胞,置于15ml离心管中,300g离心5min;
6. 用1ml生长培养基洗涤,转移至普通器皿或离心管中;
7. 用血细胞计数板对细胞进行计数;
8. 重复离心(620g,10min),弃去上清液;
9. 用分化培养基将其稀释到1×106个细胞/ml;
10. 按1ml/管分装到新Eppendorf管中;
11. 300g离心5min,上清保留不动;
12. 置于37℃孵箱;
13. 每2—3天更换培养基;
14. 培养2—3周软骨生成;