正常人关节软骨细胞的长期培养

实验材料：

1. 软骨细胞来源：20—24周自然流产胎儿的股骨和胫骨；

2. 清洗液：不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素，pH7.2；

3. 消化液Ⅰ：2mg/ml胰蛋白酶和2mg/ml胶原酶混合消化液，用PBS液配制；

4. 消化液Ⅱ：0.5mg/ml胶原酶，用培养液Ⅰ配制；

5. 培养液Ⅰ：DMEM培养液，补充10%胎牛血清；

6. 培养液Ⅱ：DMEM培养液中补加10%胎牛血清、青霉素1000IU/ml、链霉素1mg/ml、两性霉素2.5μg/ml、谷氨酰胺2mmol/L、1%维生素添加剂（vitamin supplements）以及维生素C 50μg/ml；

7. 10% poly HEMA：称取6g多聚2-羟乙基甲基丙烯酸酯（2-hydroxyethylmethacrylate，poly HEMA），加到50ml 95%乙醇中，于37℃恒温振荡水浴箱中缓慢振荡过夜，次日将所得溶液离心（2500r/min，10min），除去未溶解的颗粒，此为干液。取1ml干液与9ml 95%乙醇混合，稀释成10%（V/V）的poly HEMA溶液；

8. 筛网：孔径为100μm的尼龙筛网。

实验方法：

1. 在无菌条件下，从20—24周自然流产胎儿的股骨头和胫骨坪切取骺软骨。用PBS液洗净血液。尽量除去纤维性组织；

2. 将软骨放入消化液Ⅰ中，于37℃孵育1h；

3. 弃孵育液。将软骨块充分切碎，加入消化液Ⅱ，在37℃孵育过夜；

4. 用尼龙筛网过滤，滤液中加入培养液Ⅰ。再经250g离心5min，弃上清液；

5. 用培养液Ⅰ将细胞团吹散，重新悬浮细胞，离心。重复4次。用培养液将最后得到的细胞团制成悬液；

6. 计数细胞。从每克软骨平均可获得大约3.0×108 个软骨细胞；

7. 取0.9ml 10% poly HEMA溶液铺在直径为60mm的塑料培养皿内，水平放置在通风的超净工作台上干燥（过夜）；

8. 使用前将包被poly HEMA的培养皿用灭菌紫外灯照射30min；

9. 将含5×106 个软骨细胞的悬液接种到已包被poly HEMA的培养皿中，在37℃、5%CO2 、饱和湿度的CO2 培养箱中培养；

10. 每3—4d换一次液。培养可持续半年以上。