原理
将骨髓吸入培养液。作为附着的多层细胞，骨髓至少维持 12 周，可达 30 周。干细胞、趋向成熟的骨髓细胞和成熟骨髓细胞从附着的细胞层释放入培养液。粒细胞或巨噬细胞的祖细胞可用软凝胶培养检测。
材料与仪器
小鼠
Fischer培养液 生长培养液
注射器 纱布 拭子 解剖剪 解剖镊 培养瓶
Fischer培养液 生长培养液
注射器 纱布 拭子 解剖剪 解剖镊 培养瓶
步骤
1. 断颈处死小鼠（ 5 只小鼠：（C57BI/6xDBA/2）F1 骨髓的长期培养效果好，但一些种系的骨髓的培养效果不佳，如 CBA [ Greenberger，1980 ]）。
2. 用 70 % 乙醇泡湿毛发，切除两侧股骨。将 10 块股骨放人盛有 Fischer 培养液（含有 16 mmol/L（1.32 g/L）NaHCO3，添加50 U/ml 青霉素和 50 ug/ml 链霉素）的 Petri 培养皿内，培养皿放在冰上。1 块股骨含有 1.5x107~2.0x107 个有核细胞。
3. 在层流超净工作台操作：
(a)用纱布和拭子清除剩余的肌组织。
(b)用解剖镊固定股骨，切断膝关节端。21G 针头应能紧紧地插人骨髓腔。
(c)切断股骨的另一端，尽量靠近末端。
(d)将股骨的一端插入盛有生长培养液的 100 ml 瓶内，抽出和推压注射器活塞数次，直至将股骨内的骨髓冲洗出来。
(e)重复操作步骤 (a)~(d)，取出另外 9 块股骨内的骨髓。
4. 用 10 ml 吸管吹打大的骨髓团块，使骨髓分散成细胞悬液。
5. 按 10 ml 等量将细胞悬液分放入 25 cm2 培养瓶。不断摇晃细胞悬液，以便保证将细胞均匀地分到 10 个培养瓶中。
6. 向培养瓶中充入 5 % CO2，然后拧紧盖。
7. 在 33℃条件下，横置培养瓶，培养细胞。
8. 每周换液 1 次。
(a)轻轻摇晃培养瓶，使附着不牢固的细胞悬起。
(b)吸去 5 ml 含有悬浮细胞的培养液。注意吸管不要触到附着细胞层。
(c)向每个培养瓶中加入 5 ml 生长培养液（生长培养液：分装为 100 ml。Fischer 培养液，添加 1x10-6 mol/L 氢化可的松和丁二酸钠以及 20 % 马血清。将氢化可的松和丁二酸钠用 Fischer 培养液配制成储存液，在 -20℃ 条件下储藏）。不要将培养液直接加在附着细胞层上，以免损伤细胞。
(d)向培养瓶中充入气体后，放入培养箱。
2. 用 70 % 乙醇泡湿毛发，切除两侧股骨。将 10 块股骨放人盛有 Fischer 培养液（含有 16 mmol/L（1.32 g/L）NaHCO3，添加50 U/ml 青霉素和 50 ug/ml 链霉素）的 Petri 培养皿内，培养皿放在冰上。1 块股骨含有 1.5x107~2.0x107 个有核细胞。
3. 在层流超净工作台操作：
(a)用纱布和拭子清除剩余的肌组织。
(b)用解剖镊固定股骨，切断膝关节端。21G 针头应能紧紧地插人骨髓腔。
(c)切断股骨的另一端，尽量靠近末端。
(d)将股骨的一端插入盛有生长培养液的 100 ml 瓶内，抽出和推压注射器活塞数次，直至将股骨内的骨髓冲洗出来。
(e)重复操作步骤 (a)~(d)，取出另外 9 块股骨内的骨髓。
4. 用 10 ml 吸管吹打大的骨髓团块，使骨髓分散成细胞悬液。
5. 按 10 ml 等量将细胞悬液分放入 25 cm2 培养瓶。不断摇晃细胞悬液，以便保证将细胞均匀地分到 10 个培养瓶中。
6. 向培养瓶中充入 5 % CO2，然后拧紧盖。
7. 在 33℃条件下，横置培养瓶，培养细胞。
8. 每周换液 1 次。
(a)轻轻摇晃培养瓶，使附着不牢固的细胞悬起。
(b)吸去 5 ml 含有悬浮细胞的培养液。注意吸管不要触到附着细胞层。
(c)向每个培养瓶中加入 5 ml 生长培养液（生长培养液：分装为 100 ml。Fischer 培养液，添加 1x10-6 mol/L 氢化可的松和丁二酸钠以及 20 % 马血清。将氢化可的松和丁二酸钠用 Fischer 培养液配制成储存液，在 -20℃ 条件下储藏）。不要将培养液直接加在附着细胞层上，以免损伤细胞。
(d)向培养瓶中充入气体后，放入培养箱。
注意事项
须对全部试剂进行预试验，检査这些试剂支持细胞生长的能力。
来源：丁香实验
