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正常关节软骨细胞的短期培养

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      实验材料:
      1.软骨细胞来源:动物材料可选用未成年兔的膝关节、鸡胚胸软骨。人体材料可取自引产胎儿或成年人手术切除的软骨标本;
 
      2.清洗液:不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS,添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素,pH7.2;
      3.消化液:0.2%胶原酶Ⅱ溶液,用PBS液配制,过滤除菌;
      4.培养液:RPMI1640或Ham F12、DMEM培养基,一般在培养液中加20%—30%的小牛血清;
      5.筛网:200目铜网;
 
      实验方法:
      1.用手术刀片从关节表面削下软骨组织片,收集在PBS中。反复清洗除去软骨片表面的血液以及可能误带的滑膜组织。新鲜软骨呈乳白浅蓝色、半透明状,略具弹性;
      2.将软骨片充分剪成1mm3 以下的组织块,用PBS清洗2次;
      3.按组织块与消化液的体积比例为1:10的量加入消化液,置于37℃水浴中轻微振荡消化5h以上,直至软骨组织块基本消失、溶液变浑浊为止。或采用分阶段消化法。即每消化1h就过滤、离心1次,将分离后的软骨细胞立即放入培养液中保存起来,这样反复进行,直至所有软骨组织块消化完全;
      4.以1500r/min离心10min。收集细胞;
      5.加入PBS清洗细胞;
      6.在细胞团中加入培养液制成细胞悬液,用200目铜网过滤,收集滤液;
      7.计数细胞,根据需要调节细胞密度;
      8.以1×105 —1×106 个/ml的密度接种。置于37℃、5%CO2 、饱和湿度的CO2 培养箱中培养。每2d换1次培养液;
      9. 细胞长满瓶壁后,即可传代。届时,用PBS清洗培养物,加入0.125%胰蛋白酶溶液,37℃下消化。镜下观察可见大部分细胞间基质溶解消失。当细胞变圆时,小心倾出含酶液,加入培养液,吹打分散细胞;
      10.分瓶接种并培养;
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