从人滑膜中分离软骨祖细胞、培养、分化

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骨关节炎患者全关节置换得到的胫骨滑膜；需要正常组织时使用新鲜的尸体组织
DMEM(包含4.5 g L葡萄糖和4 mmol L L-谷氨酰胺） 黏附培养基：含100μg ml庆大霉素的DMEM 克隆生长培养基：DMEM 10% FBS和100μg ml庆大霉素 胎牛血清 牛血清白蛋白（BSA) 用PBSC配成10μg ml 血清纤连蛋白 1mg ml
Nitex细胞滤网40μm筛孔 解剖刀片 10号和23号 解剖刀柄 3号和4号 镊子 2对 离心管50ml 矿油凝胶（凡士林） 克隆环 6 mm

A.组织收集和细胞分离

(a)在无菌条件下，小心从关节周围剪下滑膜，戴好锁子甲手套的手固定平顶。

(b)将滑膜移至含PBSC的Petri培养皿中，在解剖镜下用镊子取出脂肪组织（见注释1)。

(c)将清洁后的滑膜移至新的含PBSC的Petri培养皿中（见注释2)。

(d)用刀片和镊子分离组织，与10 ml消化培养基一起移至普通器皿（见注释3)。置于滚转机上37℃过夜。

(e)加入黏附培养基，300g离心10min洗涤细胞2次。用黏附培养基重悬，2 ml中含4000个细胞。

(f)40μm Nitex细胞滤网过滤。

B.差别黏附测定（见图10.1)

(a)用纤连蛋白包被3.5cm Petri培养皿（或12孔板），4℃过夜。阴性对照使用10μg/ml BSA。

(b)滴加2 ml细胞悬液至包被的培养皿，于5% CO₂孵箱中静置20 min。

(c)吸出未贴壁细胞，弃之。

(d)加2ml生长培养基培养10天，于在第5天更换新的培养基。

C.克隆和细胞扩增（见注解5)

(a)集落（>32细胞）生成同软骨祖细胞

(b)按1个克隆/孔将细胞移至12孔板，加入含bFGF和TGF-β1的扩增培养基

(c)继续扩增细胞，将细胞从12孔板移至6孔板，再到25cm²，最后到75cm²培养瓶中。

D.分化

诱导分化的步骤基本与软骨祖细胞相同。但是，需注意培养基式不同。实验体系中14天时基质中出现Ⅱ型胶原的未成熟形式（Ⅱa）。成熟胶原（Ⅱb型)的表达需要较长的培养时间。

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注解

（1）若组织中有很多黏附的脂肪，使用23号刀片和3号刀柄比较容易操作。

（2）Hank’s平衡盐溶液（HBSS）可以取代PBSC。

( 3 )较大的组织量可以用50 ml管和30 ml培养基。

( 4 )若使用培养皿做差异黏附测定，观察克隆时，用记号笔在培养皿盖子上打点对克隆进行标记，观察克隆时据此定位。

( 5 )若克隆细胞系扩增缓慢，向培养基中加入5 ng/ml PDGF也许有所帮助

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