RFLP的操作要点

一、 材料

基因组 DNA (大于50kb,分别来自不同的材料)。

二、设备

电泳仪及电泳槽， 照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比胶块略大) 4块，吸水纸若干，尼龙膜(依胶大小而定)，滤纸 ，eppendorf管(0.5ml)若干。

三、试剂

1、限制性内切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。
　　2、5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。
　　3、变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。
　　4、中和液：1mol/LTris・Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。
　　5、10×SSC：配方见第九章。
　　6、其它试剂：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris・Cl, pH7.5/2×SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%， 0.25mol/L HCl 。

四、操作步骤

1、基因组 DNA 的酶解

(1) 大片断DNA 的提取详见基因组 DNA 提取实验,要求提取的DNA 分子量大于50kb, 没有降解。

(2) 在50μl反应体系中,进行酶切反应：
　　　　5μg基因组 DNA
　　　　5μl 10×酶切缓冲液
　　　　20单位（U）限制酶(任意一种)
　　　　加ddH2 O, 至50μl

(3) 轻微振荡, 离心,37℃反应过夜。

(4) 取5μl反应液,0.8％琼脂糖电泳观察酶切是否彻底，这时不应有大于30kb的明显亮带出现。

[注意] 未酶切的DNA 要防止发生降解, 酶切反应一定要彻底。

2、Southern转移
　　（1） 酶解的DNA 经0.8％琼脂糖凝胶电泳(可18V过夜)后EB染色观察。 　　
　　（2） 将凝胶块浸没于0.25mol/L HCl中脱嘌呤, 10分钟。 　　
　　（3） 取出胶块, 蒸馏水漂洗, 转至变性液变性45分钟。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30分钟。
　　（4） 预先将尼龙膜,滤纸浸入水中,再浸入10×SSC中,将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸(桥)然后将胶块反转放置,盖上尼龙膜,上覆二层滤纸,再加盖吸水纸,压上半公斤重物, 以10×SSC盐溶液吸印,维持18-24小时。也可用电转移或真空转移。
　　（5） 取下尼龙膜, 0.4mol/L NaOH 30秒, 迅速转至0.2mol/L Tris・Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分钟。
　　（6） 将膜夹于2层滤纸内, 80℃真空干燥2小时。
　　（7） 探针的制备和杂交见第九章分子杂交部分。

[注意]

1、 步骤（2）中脱嘌呤时间不能过长。

2、 除步骤（1）、（4）、（5）外, 其余均在摇床上进行操作。

3、步骤（4）中,当尼龙膜覆于胶上时, 绝对防止胶与膜之间有气泡发生, 加盖滤时也不应有气泡发生。

4、有时用一种限制性内切酶不能发现RFLP的差异，这时应该试用另一种酶。