非放射性Dig－dUTP

 [原理]

DNA是通过异羟基洋地黄毒苷（digoxigenin，Dig）配基标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸（dUTP）随机插入结合而被标记。dUTP通过间臂连结类固醇半抗原异羟基洋地黄毒苷酸基，形成Dig-dUTP，杂交反应后，杂交的靶DNA通过酶联免疫法与一个抗体复合物[抗异羟基洋地黄毒苷配基碱性磷酸酶复合物（Dig）Ap]结合，接着在5-溴-4氯-3-吲哚磷酸盐（X-磷酸盐）和硝基四氮唑蓝（NBT）存在下，由酶催化反应，在杂交部位形成蓝紫色带或颗粒。

［操作］

1．转移

通过打点吸渍、噬菌斑或Sonthern印迹转移等方法，把被测的DNA转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上。

2．标记探针

取微型离心管于冰上，依次加入：lμg新鲜变性的DNA；2μl六聚核苷酸混合物；2μl dNTP标记用混合物；加无菌双蒸水至 19μL；加 lμl  DNA聚合酶大片段。37℃保温 1小时至20小时，加入 2μl EDTA（0.2 mol/L），终止反应，加 2μL 4mol/L LiCl，75μl预冷的乙醇沉淀DNA，- 70℃ 30分钟或-20℃ 2小时、离心收集沉淀物，真空干燥后加 50μl  TE溶解。

3．预杂交

膜放入袋内 68℃预杂交 1小时，每 100cm2膜至少用 20ml预杂交溶液。

4．杂交

每100cm2膜用2.5 ml杂交液（杂交溶液用预杂交溶液中加新鲜变性的探针组成），68℃至少杂交6小时。

5．洗膜

室温下用50ml 2×SSC， 0.1％（W/V）SDS洗膜，5分钟× 2次，68℃用0.1×SSC， 0.1％（W/V）SDS洗膜，15分钟×2次，晾干。

6．检测

（1）膜在缓冲液中洗涤1分钟。

（2）缓冲液Ⅰ稀释抗体结合物至150 mU/ml（l:5000），稀释后的抗体结合物在4℃只能稳定12小时。

（3）膜在20ml稀释的抗体结合物溶液中保温30分钟。

（4）用缓冲液Ⅰ洗膜15分钟×2次。

（5）在缓冲液Ⅱ中平衡2分钟。

（6）在黑暗条件下，膜与新鲜配制的显色溶液放塑料袋内密封或放入合适的盒子内，几分钟开始显色。

（7）用50ml缓冲液IV洗膜5分钟，终止反应。

（8）摄影记录结果。

[试剂与器材]

1．试剂

DNA稀释缓冲液：Tris.Cl(10mmol/L)，EDTA(lmmol/L)pH 8.0，内含鱼精 DNA 50μg/ml。

10×六聚核苷酸反应混合物。

dNTP标记用混合底物：lmmol/L dATP: 1mmol/L dCTP；lmmol/L dGTP；0.65 mmol/L dTTP；0.35mmol/L DigdUTP，pH6.5（20℃）。

DNA聚合酶 I大片段（标记级）：2 U/μl。

(Dig)Ap结合物：多克隆抗异羟基洋地黄毒苷配基Fab片段，结合有碱性磷酸酶750 U/ml。

NBT：浓度为 75mg/ml，溶于 70％（V/V）二甲基甲酰胺硝基四氮唑蓝盐溶液。

X-磷酸盐：50mg/ml，溶于二甲基甲酰胺的5-溴-4氯-3-吲哚磷酸盐。

封阻试剂：粉剂

0.2 mol/L EDTA，pH 8.0（20℃）

4mol/L LiCl

70％乙醇

10％（V/V）N-十二烷基肌氨酸钠盐.

10％ SDS

20 × SSC

杂交溶液：5×SSC；0.l％（W/V）封阻试剂；0.02％（W/V）SDS。    缓冲液Ⅰ：100 mmol/L Tris-CI；150mmol/L NaCl，PH7.5（20℃）。

缓冲液Ⅱ：0.5 %（W/V）封阻试剂溶于缓冲液中，封阻试剂不会快速溶解，因此应提前1小时配制此溶液，将试剂溶于50～70℃，此溶液保持混浊。

缓冲液Ⅲ：100 mmol/L Tris Cl；100mmol/L NaCl；50mmol/L NaCl；50mmol/L MgCl₂，pH9.5(20℃)。

缓冲液IV：10mmol/L Tris Cl；1 mmol/L EDTA，pH 8.0(20℃)。

显色溶液（新鲜配制）：10ml缓冲液Ⅲ中，加 45μl NBT溶液和 35μl X-磷酸盐溶液。

2. 器材

常规实验室仪器设备。