质粒大量提取之碱裂解法

该法是R.Treisman尚未发表的方法，同时也是Brinboim和Doly(1979)及Ish-Horowicz和Burke(1981)所用方法的改进。该方法对于目前使用的所有大肠菌菌株都卓有成效，并可与随后的纯化步骤，如聚乙二醇沉淀或氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心等，一并联合使用。注:括号中给出的体积可适用于未经氯霉素处理的培养。

试验准备:

1、溶液I:50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)10mmol/L EDTA(pH8.0)溶液I可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15min，贮存于4℃。

2、溶液Ⅱ: 0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)1%SDS 盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。防止NaOH接触空气中的CO₂所以要现用现配。

3、溶液Ⅲ:5mol/L乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml。所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。

4、溶菌酶溶液: 10mg/ml，溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)。

试验步骤:

1、将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物，重悬于10ml(18ml)溶液I中。

2、加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液。

3、加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。

4、加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。于冰上放置10min，会出现一白色絮状沉淀。沉淀应包括染色体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合物。

5、用SorvallGS3转头(或与其相当的转头)于4℃以4000rpm离心15min，使转头自然停止转动。如果细菌碎片贴壁不紧，则可以5000rpm再度离心20min，然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分。

6、用4层干酪包布把上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10min。

7、用Sorvall GS3转头(或与其相当的转头)于室温以500rpm离心15min，回收核酸。盐也会在4℃离心时沉淀下来。

8、小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，室温下用70%乙醇洗涤沉淀。倒出乙醇，并除去附于瓶壁的所有液滴，室温下将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发完全。

9、用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。