碱裂解法大量提取质粒（500mL菌液）

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碱裂解法 大量提取质粒(500mL菌液)

1、取培养至对数生长后期(一般培养12～16小时)的含待提质粒的细菌 培养液于离心杯中，配平，4℃下4000rpm离心15min，弃上清，然后将离心管倒置于干净的约纸上使上清液全部流尽。

2、向盛有细菌 沉淀物的离心管中加入20mL冰冷的溶液Ⅰ，重悬沉淀(先加5mL溶液Ⅰ，用干净的玻璃棒搅拌均匀后，再加剩下的部分)。

3、加入40mL冰冷的新配制的溶液Ⅱ，盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心数次，使离心管内溶物充分混匀。此步需注意：混匀过程不可用力过猛，否则容易导致基因组 DNA污染。正确的方法是：缓缓地颠倒离心管数次或双手持管使其轴线水平，并使管沿轴线旋转，直到内容物粘稠有“拉丝”为止。

4、加30mL用冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧瓶盖，摇动离心管数次以混匀内容物，冰上放置15 min，此时应形成白色絮状沉淀。

5、配平，4℃下4400rpm离心15min。注意：如果第4步混合不均匀，则不能形成致密的沉淀，下步取上清液则应用纱布过滤。

6、用纱布过滤取上清液，加入0.6倍体积异丙醇，-20℃静止20min使质粒 沉淀。

7、配平，4℃下8500rpm离心10min，弃上清，倒置于吸水纸上。沉淀用数mL70%乙醇洗，干燥后，用10mL的TE溶解质粒沉淀。

8、加等体积冰预冷5mol/L的LiCl溶液，混匀后，4℃下放置10min。此步的目的是使大片段的RNA和大分子的蛋白质沉淀。

9、配平，4℃下8500rpm离心10min，保留上清，加2倍的无水乙醇，-20℃静置20min使质粒沉淀。

10、同7步，并将质粒溶液中加入20μL的RNaseA(终浓度20μg/mL)，37℃放置0.5-1h。

11、分别加入等体积萃取液(酚：氯仿：异戊醇=25：24：1)，振荡混匀，配平，4℃下8500rpm离心10 min。

12、取上层水相至新的EP管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)，振荡混匀，配平，4℃下8500rpm离心10 min。

13、取上层水相于新的EP管中。注意：13和14步对提高提取的质量和产率比较重要。

14、加入等体积的PEG-NaCl溶液，轻轻混匀，室温静置30min(大于10min)。

15、配平，4℃下8500rpm离心10min，沉淀用数mL70%乙醇洗。

16、待乙醇挥发干净后，将沉淀溶于1-5mLTE或DDW(双蒸水)中。

溶液配制

一、溶液Ⅰ配制

溶液Ⅰ组成：葡萄糖，EDTA，Tris-HCl。三种物质在溶液Ⅰ中的终浓度分别为：0.05mol/L葡萄糖，0.025mol/L Tris-HCl、pH8.0，0.01mol/L EDTA、pH8.0。

配制方法：按上述各物质终浓度，把各自均配制成十倍浓度的溶液，配制溶液Ⅰ时，取三种十倍溶液各1体积于一容器中，定容至10体积即得溶液Ⅰ。

配制体积 500mL 1000mL

(1)葡萄糖(M=198.17)： 0.05 mol/L 4.954g 9.909g

10倍： 0.5 mol/L 49.54g 99.09g

(2) Tris-HCl(M=121.1): 0.025 mol/L 1.514g 3.028g

10倍： 0.25 mol/L 15.14g 30.28g

(3)EDTA(M=372.24): 0.01 mol/L 1.861g 3.722g

10倍： 0.1 mol/L 18.61g 37.22g

注：溶液Ⅰ一次可配制100mL或更多，在15psi(1.05kg/cm2)压力下蒸汽高压灭菌15～30min，保存于4℃环境中备用。

二、溶液Ⅱ配制(现用现配，不用高压灭菌)

溶液Ⅱ组成：NaOH,SDS。两种物质在溶液Ⅱ中的终浓度分别为：0.2mol/L NaOH，1%SDS(m/V)。根据需要体积(V)，各自配制成2倍浓度1/2体积(V/2)，两者等体积混合即得。

配制体积 250mL 500mL

(1)NaOH(M=40.01)： 0.2 mol/L 2.00g 4.00g

2倍： 0.4 mol/L 4.00g 8.00g

(2)SDS(M=121.1): 1% 2.5g 5g

2倍： 2% 5g 10g

三、溶液Ⅲ配制(用乙酸调Ph4.8)

溶液Ⅲ组成：乙酸钾，冰乙酸。两种物质在溶液Ⅲ中的终浓度分别为：5mol/L乙酸钾，冰乙酸(由溶液Ⅲ体积决定)，即配制100体积溶液Ⅲ：60体积5mol/L乙酸钾，11.5体积冰乙酸，28.5体积灭菌水。

例如：预配制100mL溶液Ⅲ：

5mol/L乙酸钾： 60.0mL

冰乙酸： 11.5mL

灭菌水： 28.5mL

配制体积 500mL 1000mL

(1)乙酸钾(M=98.14)： 5mol/L 245.35g 490.7g

注：溶液Ⅲ不需要高压灭菌，但5mol/L乙酸钾溶液需要高压灭菌!

三、TE溶液配制(需要高压灭菌)

TE溶液组成：Tris-HCl，EDTA。两种物质在TE溶液中的终浓度分别为：0.01mol/L Tris-HCl、pH8.0,0.001mol/L EDTA、pH8.0。

配制体积 500mL 1000mL

(1) Tris-HCl(M=121.1): 0.01 mol/L 0.6055g 1.211g

10倍： 0.1 mol/L 6.055g 12.11g

(2) EDTA(M=372.24): 0.001 mol/L 0.1861g 0.3722g

10倍： 0.01 mol/L 1.861g 3.722g

注：TE溶液使用量比较大时，可配制成十倍的TE溶液，用时再稀释。

五、5mol/L氯化锂溶液配制(需要高压灭菌)

配制体积 500mL 1000mL

(1)无水氯化锂(M=42.39)： 5mol/L 105.98g 211.95g

(2)一水氯化锂(M=60.41)： 5mol/L 151.025g 302.05g

六、PEG-NaCl溶液配制(不用高压灭菌)

PEG-NaCl溶液组成：PEG8000，NaCl。两种物质在TE溶液中的终浓度分别为：13%PEG(m/V),1.6 mol/L NaCl。(注：m/V即质量/体积)

配制体积 500mL 1000mL

(1)PEG(M=)： 13% 65g 130g

(2)NaCl(M=58.44)： 1.6 mol/L 46.75g 93.50g

七、LB液体培养基配制(高压灭菌)

配制一升LB液体培养基配方： 一倍配方 十倍配方

(胰)蛋白胨： 10g 100g

酵母提取物： 5g 50g

氯化钠： 5g 50g

注：液体培养基用量较大时，可配制成10倍的培养基，用时稀释即可。

八、LB固体培养基配制(高压灭菌)

配制一升LB固体培养基配方：

(胰)蛋白胨： 10g

酵母提取物： 5g

氯化钠： 5g

琼脂粉： 15g

九、核糖核酸酶A溶液配制

制备不含DNA酶的RnaseA：将胰核糖核酸酶(RnaseA)溶解在0.01mol/L的醋酸钠缓冲液(pH5.2)中，使终浓度为10mg/mL，沸水煮15min，放在室温下，缓慢冷却，用0.1体积的1M Tris-HCl(pH8.0)调整pH至7.4左右，分装小管保存在-20℃备用。

注：当浓缩的溶液在中性pH条件下加热到100℃时，核糖核酸酶(RnaseA)会产生沉淀。