碱裂解法大量提取质粒DNA(同时纯化)
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准备工作:
细菌培养:小量提取质粒DNA 鉴定正确后,将菌液以1/50~1/20体积的比例接种到250ml液体培养基中,37℃振荡培养过夜至对数生长晚期。
注:培养体积与最终质粒DNA 的收获量并无线性关系。只要培养条件适宜,50ml的培养液有时也可得到总量高达1mg以上的质粒。
操作步骤 :
1、细菌的收获:将菌液倒入合适的离心管中,8000g离心5分钟,弃上清,并在吸水纸上倒置离心管使上清全部流尽。
2、将细菌沉淀重悬于10ml溶液I中。
溶液I:50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris•Cl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0)
注:(1)若溶液Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ配制时间过久,可加入少量溶菌酶;(2)由于沉淀的影响,悬液的体积会达到11~13ml。
3、加15ml溶液Ⅱ,颠倒混匀。
溶液Ⅱ:0.2mol/LNaOH,1%SDS
4、加12ml溶液Ⅲ,轻微振荡混匀。
溶液Ⅲ:5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5ml
5、12000g离心5分种,弃沉淀。将上清转移到另一离心管中。
6、加入60%体积的异丙醇,颠倒混匀后,室温静置5分钟。12000g离心5分钟,弃上清。
7、沉淀溶解于4~6mlTE中,加入1/50体积RNaseA贮存液,颠倒混匀,37℃静置10分钟。
8、加入1/2体积的Tris饱和酚、1/2体积的氯仿-异戊醇(24:1)混合液,剧烈振荡混匀。
9、4℃12000g离心30秒,将上层液体与少量下层液体转移到另一离心管后,再12000g离心5分种,小心吸取上层液体。
10、加入等体积13%聚乙二醇(PEG8000)-1.6mol/LNaCl混合液,颠倒混匀,冰上静置0.5~2小时。
11、4℃12000g离心10分种,弃上清,DNA 沉淀用70%乙醇洗涤。
12、沉淀干燥后,溶解于适量高压灭菌的水中。
注:(1)溶解体积一般为0.2~1ml;(2)此时得到的是已经纯化的质粒DNA ,可直接进行各种酶学操作。
13、取样品进行电泳或紫外定量。