碱裂解法质粒DNA的提取、纯化和检测
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一、实验目的
了解碱裂解法制备质粒的原理，掌握小量质粒的制备方法。
二、实验原理
质粒DNA的抽提是分子生物学实验操作中最常用与最基本的技术，现已有多种成熟的方案可供选择。最常用的方法是根据碱性条件下质粒DNA与染色体DNA变复性能力的不同进行分离；也有利用酸性、低离子强度时超螺旋在水相中，开环、线型分子在酚相中进行分离的酸酚法；还有利用羟基磷灰石在特定的条件下(8mol／L尿素，0.24mol／L磷酸缓冲液pH＝6.8)吸附双链DNA的羟基磷灰石法(在上述条件下染色体DNA均成单链，质粒DNA保持双链)等。本实验选用的是碱裂解法。
1、 裂解细胞 裂解细胞指通过溶菌酶、去污剂等试剂破裂细胞壁与细胞膜的过程。对于不同的菌选用不同的方法，通常有煮沸法、非离子型去污剂法、碱性SDS法(简称碱法)等。其中，非离子型去污剂法较温和，适用于抽提10kb左右的质粒；煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈，只能抽提小于10kb的质粒。常用的离子型去污剂是SDS、非离子型去污剂有Triton X-100等。
2、 分离 将质粒DNA和染色体DNA分离。碱法的分离原理如下：大肠杆菌的染色体约有4700kb长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双链DNA片段。当溶液的pH调到大于12时双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链分离成单链；而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢键被破坏，并只发生部分双链解离成单链的变化。再当pH调回中性时单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。
3、 纯化 细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外还有各种细胞壁、膜碎片、蛋白质、脂质类物质及RNA。纯化的步骤就是有针对性地将它们去除。RNA可用牛胰Rnase A分解除去。蛋白质可通过酚、酚／氯仿、苯酚/氯仿/异戊醇，使蛋白质变性而除去，同时，氯仿有强烈的溶脂倾向，在除去蛋白质的同时可去除脂质类杂质。氯仿还能将微量的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉，而微量的酚对于以后的酶切、转化等过程都会产生不利影响。苯酚/氯仿/异戊醇的蛋白质变性能力较弱，主要用于含酚试剂处理后的抽提。
正确的去除蛋白质杂质的过程应该是酚一酚+氯仿(1:1)一氯仿（或苯酚/氯仿/异戊醇25:24:1)，处理，根据实验情况也可考虑省略第一或第二步，但切记不可将氯仿（苯酚/氯仿/异戊醇）的处理步骤省略掉。抽提过程完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法将它们除去。用无水乙醇沉淀的特点是能将DNA进行浓缩，且同时也更换了整个缓冲系统，但DNA也有一定的损失。
三、实验仪器和材料 核酸基因实验论坛 http://bbs.bbioo.com/forum-137-1.html
实验仪器同实验项目1;材料为含pUC19质粒的DH5ɑ菌（由教师准备）。
四、实验试剂
1.LB培养液(1L)
用10mol／L NaOH调至pH7.0，高压蒸气灭菌, 4℃贮存.
2.溶液Ⅰ，可成批配置，灭菌(121℃,20min)后4℃贮存。
3.溶液Ⅱ(新鲜配制)
4．溶液Ⅲ
配制好的溶液Ⅲ含3mol／L钾盐，5mol／L 醋酸(pH4.8)
5．氨苄青霉素(Amp): 200mg/ml, 过滤除菌.
6．重蒸酚 市售苯酚蒸馏纯化(收集179-181℃之间的酚)后，用TE饱和，使水相的pH在7.5以上，4℃保存。
7．苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)
8．无水乙醇
9．RNaseA(10mg／ml)
10．3mol／L NaAc(pH5.2)
11．TE 10mmol／L Tris•HCl(pH8.0) 1mmol／L EDTA
了解碱裂解法制备质粒的原理，掌握小量质粒的制备方法。
二、实验原理
质粒DNA的抽提是分子生物学实验操作中最常用与最基本的技术，现已有多种成熟的方案可供选择。最常用的方法是根据碱性条件下质粒DNA与染色体DNA变复性能力的不同进行分离；也有利用酸性、低离子强度时超螺旋在水相中，开环、线型分子在酚相中进行分离的酸酚法；还有利用羟基磷灰石在特定的条件下(8mol／L尿素，0.24mol／L磷酸缓冲液pH＝6.8)吸附双链DNA的羟基磷灰石法(在上述条件下染色体DNA均成单链，质粒DNA保持双链)等。本实验选用的是碱裂解法。
1、 裂解细胞 裂解细胞指通过溶菌酶、去污剂等试剂破裂细胞壁与细胞膜的过程。对于不同的菌选用不同的方法，通常有煮沸法、非离子型去污剂法、碱性SDS法(简称碱法)等。其中，非离子型去污剂法较温和，适用于抽提10kb左右的质粒；煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈，只能抽提小于10kb的质粒。常用的离子型去污剂是SDS、非离子型去污剂有Triton X-100等。
2、 分离 将质粒DNA和染色体DNA分离。碱法的分离原理如下：大肠杆菌的染色体约有4700kb长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双链DNA片段。当溶液的pH调到大于12时双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链分离成单链；而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢键被破坏，并只发生部分双链解离成单链的变化。再当pH调回中性时单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。
3、 纯化 细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外还有各种细胞壁、膜碎片、蛋白质、脂质类物质及RNA。纯化的步骤就是有针对性地将它们去除。RNA可用牛胰Rnase A分解除去。蛋白质可通过酚、酚／氯仿、苯酚/氯仿/异戊醇，使蛋白质变性而除去，同时，氯仿有强烈的溶脂倾向，在除去蛋白质的同时可去除脂质类杂质。氯仿还能将微量的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉，而微量的酚对于以后的酶切、转化等过程都会产生不利影响。苯酚/氯仿/异戊醇的蛋白质变性能力较弱，主要用于含酚试剂处理后的抽提。
正确的去除蛋白质杂质的过程应该是酚一酚+氯仿(1:1)一氯仿（或苯酚/氯仿/异戊醇25:24:1)，处理，根据实验情况也可考虑省略第一或第二步，但切记不可将氯仿（苯酚/氯仿/异戊醇）的处理步骤省略掉。抽提过程完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法将它们除去。用无水乙醇沉淀的特点是能将DNA进行浓缩，且同时也更换了整个缓冲系统，但DNA也有一定的损失。
三、实验仪器和材料 核酸基因实验论坛 http://bbs.bbioo.com/forum-137-1.html
实验仪器同实验项目1;材料为含pUC19质粒的DH5ɑ菌（由教师准备）。
四、实验试剂
1.LB培养液(1L)
| 蛋白胨 | 酵母提取物 | NaCl |
| 10g | 5g | 10g |
2.溶液Ⅰ，可成批配置，灭菌(121℃,20min)后4℃贮存。
| 葡萄糖 | Tris•HC1(pH8.0) | EDTA(pH8.0) |
| 50mmol／L | 25mmol／L | 10mmol／L |
| NaOH | SDS |
| 0.2mol／L | 1％ |
| 5mol／L KAc | 冰醋酸 | 无菌水 |
| 60ml | 11.5ml | 28.5ml |
5．氨苄青霉素(Amp): 200mg/ml, 过滤除菌.
6．重蒸酚 市售苯酚蒸馏纯化(收集179-181℃之间的酚)后，用TE饱和，使水相的pH在7.5以上，4℃保存。
7．苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)
8．无水乙醇
9．RNaseA(10mg／ml)
10．3mol／L NaAc(pH5.2)
11．TE 10mmol／L Tris•HCl(pH8.0) 1mmol／L EDTA
