标记免疫分析技术的发展点评

本文叙述了目前免疫分析技术的发展趋势，酶、荧光以及化学发光等免疫分析的发展及最新技。

Yalow和Berson建立了RIA为生物医学分析开创了一个新的领域，从而使体内超微量活性物质的分析获得了飞跃发展，在医学和生物学领域得到广泛应用。由于RIA具有灵敏度高，特异性强，测量简单，成本低等优点，RIA具有一定的生命力。但因为它必须使用放射性核素，需要防护和防止污染；标记物有效使用时间短；难以实现操作和测量的自动化等，它的进一步发展受到一些局限。上世纪70年代末和80代年初非同位素标记的免疫分析发展起来，非放免分析[1-5]除克服了RIA固有的缺陷，灵敏度、测量范围较宽、且容易实现自动化，发展速度非常快。

JamesP.Gosling[6]根据在《ClinicalChemistry》发表的文章统计，国际上在免疫分析中采用同位素标记所占的比例由1980年的60%下降为1989年的25%，而非同位素标记由1980年的不足40%上升为1989年的75%。英国的TSH免疫分析实验室采用同位素标记方法由1987年的230家下降为1995年的60家，而采用非同位素由1987年的50家上升为1995年的280家。统计结果及市场信息表明，RIA在国际及国内的发展速度减慢，而非放免分析的发展迅速，总趋势是从RIA转向灵敏度高、测量范围宽、应用范围更广的全自动化的非放免分析，并与RIA共存一段时间。

1971年，Engvall和Perlaman及Weeman和Schuur两组学者用酶代替同位素制备了酶标记试剂，创立了酶免疫分析技术（EIA）。至今有二十多种酶被应用于EIA[7-9]，但应用最多的仍然是辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。EIA除了避免放射性同位素的危害外，最重要的优点是酶标记物的有效期大大超过了125I标记物。但普通的EIA的灵敏度不高，稍逊于RIA。EIA正朝着多样化和更先进的方向发展，如采用酶解抗体片断进行标记，采用生物素-链亲和素放大系统，采用微粒、脂质体或红细胞等作为标记物载体以包载大量标记物的放大系统，采用PCR技术的PCR-EIA分析，采用增强发光-EIA（ELEIA）等。目前发展的最新技术是将EIA与荧光技术或化学发光技术结合，形成荧光酶免疫分析（FEIA）及化学发光酶免疫分析（CLEIA），从而大大提高灵敏度，增大检测范围。如英国Amersham公司的Amerlite免疫分析试剂盒和美国DPC公司的Immulite免疫分析试剂盒都是应用ELEIA。目前国外有多种化学发光酶免疫分析（CLEIA）系统的商业试剂药盒和自动化仪。我国EIA试剂药盒尚处在普通的EIA和ELISA阶段。

传统荧光免疫分析（FIA）受到散射光、来源于样品的背景荧光和荧光淬灭等因素的干扰，分析灵敏度较低，为10-8-10-12mol水平。20世纪80年代初发展的时间分辨荧光免疫分析（TRFI2A），用镧系元素作为示踪物标记抗体或抗原，利用时间分辨荧光测量法排除样品中非特异性干扰，从而有效地提高了测量的灵敏度，它的检测限可超过10-8mol，标记物制备简便，有效期长，标准曲线量程宽，可重复激发重复测量，应用范围广，可实现多标记对多个待测物同时检测和自动化，因而受到生物医学工作者的青睐，成为20世纪90年代标记免疫分析技术中的新秀。

TRFIA有两种分析系统

1、EG&GWallac公司推出的“解离增强镧系荧光免疫分析系统（DELFIA）”

2、加拿大多伦多大学DiamandisEP等人创立的©1995-2003TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.，td.Allrightsreserved.“Cybgerfluor系统”。目前最新技术有：应用多标记、共包被等技术实现多个待测物同时检测；研制具有足够络合稳定性、良好的亲和性和优良的可检测性的配基作为标记物，以克服DELFIA固有的易受外源性污染影响等缺陷；选择活性基团密度高的载体实现多重标记以提高分析灵敏度；以及荧光极化的均相免疫分析技术等。目前，国外的TRFI2A系列试剂盒已成商品化；高度自动化荧光测量仪已进入第三代。如Pharmacia公司生产的TRFIA试剂盒已达40余种，包括检测甲状腺激素、甾体类激素、病毒性肝炎、药物、多肽类和蛋白质类等。应用范围包括基础药物和临床医学各领域。20世纪80年代中期我国开展这方面的实验研究，目前已有部分药盒问世。

化学发光免疫分析（CLIA）是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，藉以检测抗原或抗体的分析技术。自上世纪70年代中期Arakawe首先报道CLIA，发展至今已经成为一种成熟的、先进的超微量活性物质检测技术，应用范围非常广泛。主要的优点是

1、高灵敏度，由于不需要外来光源，具有比荧光法更高的信噪比，最低可以检测到100个分子（10-21mol），灵敏度比RIA或EIA大1至2个数量级，与TRFIA相当甚至超过

2、发光标记物稳定，有效期长，达数月甚至数年

3、检测范围宽，可达6个数量级

4、自动化程度高，可提高检测工作效率，避免了手工操作带来的误差，提高了分析方法的精密度。近10年来CLIA发展迅猛，是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法之一。国外有多种商业化的CLIA系统，如CibaCoring公司的MagicLiteSystem和Behring公司的BeriluxSys2tem，前者用吖啶酯，后者用吖啶磺酰胺作发光物质标记抗体或抗原，用HNO3+H2O2和NaOH作发光启动试剂。而Amersham公司的AmerliteSys2tem和DPC公司的ImmuliteSystem，均是用酶作催化剂，加入发光底物和增强剂的酶促的CLIA系统，前者用HRP标记，鲁米诺或异鲁米诺及其衍生物作发光底物，用NaOH+H2O2作发光启动试剂；后者用AP标记，（金钢烷）-1，2-二氧乙烷衍生物作发光底物和发光启动试剂。另外BoehringerMannheim公司的ElesysSystem，是用三联吡啶钌Ru（bty）32+作发光标记物的电化学发光免疫分析（ECLIA）系统。采用吖啶酯作发光标记物的MagicLiteSystem，电化学发光的ElesysSystem和ACCESSSystem[20，21]技术更具有优越性和先进性，更受用户的欢迎。吖啶酯作为发光标记物具有不需要催化剂、自然本底低、受外界因素干扰少、信噪比高、标记简单且标记后不降低发光信号和标记物稳定等优点。ECLIA是目前最有发展前途的一种免疫分析方法，它具有实现均相测量和多元检测等独特的优点。同时化学发光仪已发展成为全自动化，全部工作由计算机控制：即从加样、传输、温育、分离、洗涤和测量到数据处理和结果打印，全部实行自动化。国外的全自动化学发光仪很多，如CibaCoring公司的ACS：180；BoehringerMannheim公司的Elesys1010、Elesys2010和ES600；BeckmanCoulter公司的AC2CESS@Aanlyzer；DPC公司的Immulite2000Analyzer；JapanShowaUniversity公司的Lu2minomaster[TM]Analyzer；Wallac公司的Flash′nglow；PerkinElmer公司的TR717等。

总之，目前，多种免疫分析方法并存，相互竞争，相互补充，但非放免分析相对RIA更具有综合优势和潜力，发展速度更快。CLIA和TRFIA是非放免分析的两大主流，但从发展速度和市场应用推广来看，CLIA更具有竞争力。但不管怎样，目前还没有一种免疫分析技术是完美无缺的。因此，各种技术还需要不断发展和完善，并且人们还在不断研究，以开发出更新更理想的免疫分析技术。