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常用标记免疫酶及其底物

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1 .标记酶的选择条件

活性高,分解底物的能力强。

特异性强,即作用于底物的专一性强。

与抗原抗体结合后仍保持酶的活性。

与底物作用可以显色。

纯度高、易纯化,即含杂蛋白少。

可溶性 ( 水溶性 ) 好,在溶液中稳定。

测定方法简单。

酶来源方便、价格低廉。

2 .符合条件的酶

辣根过氧化物酶 (Horseradish peroxidase HRP) ,分子量 40 000

碱性磷酸酶( Alkaline phosphatase AKP ),分子量 82 000

⑶ β- 半乳糖甙酶(β-galactosidase ),分子量540 000

 

⑷ 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, 分子量186 000

 

其中以HRP 最为常用,因其具有活力高、稳定、分子量小、易提纯等优点。

3 .辣根过氧化物酶 HRP 广泛地分布于植物界,以辣根中含量最高。它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉辅基组成的一种糖蛋白,含糖量 18% ,它由 300 个氨基酸和 4 个二硫键连接而成。分子量 40 000 ,等电点 5.5 9.0 之间,它催化的最适 pH 因供氢体不同而有所差异,但多在 pH5.0 左右。 HRP 易溶于水和 58% 以下的饱和硫酸铵溶液。

HRP 酶蛋白和其它杂蛋白的最大吸收光谱为 275nm ,辅基部分的最大吸收光谱为 403nm ,二者比值 OD403 /OD275 为酶的纯度。以 RZ (Reinheit Zabl 德文 ) 表示。 RZ 3 为高质量, RZ 2.5 为中等质量, RZ 2.5 则需要纯化。 RZ 值越小,表示杂蛋白越多 , RZ 0.6 ,则表示有 75% 的杂蛋白。

衡量酶质量的标准有两条,一个是纯度即 RZ 值,一个是活力。只用酶的纯度表示是不全面的。目前国际上规定 , 酶的活力以国际单位表示。一个酶单位是在一定的条件下 (pH 、温度和底物浓度 ) 一分钟能降解 1mMol/L 底物的酶活力。 1mg 酶所含有酶的单位数称为比活性。用比活性进行酶的比较。

用作标记的过氧化物酶活性一般要大于 250units/mg

4 HRP 的作用底物与供氢体 底物为 H2 O2 ,催化时需供氢体。

组化法常用的供氢体是 3 3 -二氨基联苯胺盐酸盐 (3.3 diamino benzidine . DAB) 。其反应物由于形成的氧化型中间体迅速聚合,形成不溶性的棕色吩嗪衍生物,可用于光学显微镜观察。这种多聚物能还原和螯合四氧化锇 (OS O4 ) 形成具有电子密度的产物,可适用于电子显微镜观察。

用于 ELISA 的供氢体有下列数种。

ELISA 的供氢体

 

反应颜色

波长

终止剂

终止

颜色

测定波长

联大茴香胺 (OD)

桔红

512

5Mol/L HCI

400

邻苯二胺 (OPD)

444

2Mol/L H2 SO4

桔黄

492

邻苯甲苯胺 (OT)

636

2Mol/L H2 SO4

442

5 -氨基水杨酸

475

1Mol/L NaOH

449

OD OPD 最为常用。 OPD 有致癌作用,使用时需注意。

5 .碱性磷酸酶 可从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。它是一种磷酸脂酶 , 其作用是催化磷酸-脂水解释放出无机磷酸而显色。或者通过水解产生的磷酸与钼酸反应生成磷钼酸,然后在还原剂作用下生成蓝色的产物进行测定。

 

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