一步实现单拷贝到高拷贝的转换---CopyControl克隆技术
互联网
2808
单拷贝 克隆 产量低，高拷贝 克隆 稳定性差，一直让研究者在 克隆 表达时难以选择。蛋白的表达就有诱导表达系统，可以实现人为地控制蛋白的表达时间和表达量——现在连质粒的拷贝数可以借助诱导的方法来人为控制了！Epicentre的专利技术——CopyControl 克隆 系统能够让您共享单拷贝和高拷贝的优点。CopyControl 克隆 首先以单拷贝形式生长——单拷贝可以确保插入稳定及成功 克隆 编码毒性基因序列——在需要的时候，再诱导成高拷贝 克隆 ，以便下游应用所需。这一系统可以用来构建PCR 克隆 ，对于BAC，fosmid文库等大型质粒格外有用。
CopyControl 克隆 系统有两个重要的成分：
1．CopyControl pCC1 Vector.
这个载体含有两个复制起始位点（如图1）：单拷贝的大肠杆菌F-因子复制子，和诱导型的高拷贝oriV。 OriV的启动，需要trfA基因产物，trfA基因既不在pCC1 Vector上，也不在其他常规用来 克隆 的大肠杆菌菌株中，这个基因由CopyControl 的第二个重要元件—— TransforMax EPI300 E.coli菌株提供。
1．CopyControl pCC1 Vector.
这个载体含有两个复制起始位点（如图1）：单拷贝的大肠杆菌F-因子复制子，和诱导型的高拷贝oriV。 OriV的启动，需要trfA基因产物，trfA基因既不在pCC1 Vector上，也不在其他常规用来 克隆 的大肠杆菌菌株中，这个基因由CopyControl 的第二个重要元件—— TransforMax EPI300 E.coli菌株提供。
2．TransforMax EPI300 E.coli.
这是一个工程菌株，含有受诱导启动子严谨控制的trf A基因，在诱导表达的条件下可以提供启动oriV所需要的trf A基因产物。另外phage T1-resistant TransforMax EPI300-T1R E.Coli也可提供这个基因的产物。
这是一个工程菌株，含有受诱导启动子严谨控制的trf A基因，在诱导表达的条件下可以提供启动oriV所需要的trf A基因产物。另外phage T1-resistant TransforMax EPI300-T1R E.Coli也可提供这个基因的产物。
<center>
<table>
<tbody>
<tr>
<td>
<img src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/12/26/A1388040801.jpg" />
<div>
图1</div>
</td>
<td>
</td>
</tr>
</tbody>
</table>
</center>
CopyControl 克隆 和 克隆 诱导步骤（图2）：
-
将目标DNA片断连接到已经线性化、去磷酸化的CopyControl pCC1 Vector上。
-
转化感受态细胞（TransforMax EPI300 E.coli），涂皿，在氯霉素LB培养基上筛选。在这种条件下，trfA基因的表达被抑制， 克隆 以单拷贝数量生长。
-
挑选 克隆 ，单个培养。
-
加CopyControl诱导溶液到管中。诱导溶液诱导TransforMax EPI300 宿主细胞内trfA基因的表达，从而启动oriV， 克隆 由单拷贝转化为高拷贝。
-
用常规方法从诱导细胞内分离DNA。
这个系统用于常规PCR 克隆 或者文库构建时，经过诱导，每个细胞中的质粒拷贝数可以从1个提高到200个，非常厉害，对于下游的表达或者核酸纯化、测序等都很有帮助。而对于BAC和Fosmid等低拷贝的大型质粒来说，单拷贝的 克隆 的稳定性是非常重要的考虑因素，经过诱导后每个细胞中质粒的拷贝数可以达到10—50个，对于后继的实验更有重要的意义。
<center> <p> </p> </center>
上一篇：PCR产物的克隆 下一篇：克隆心得��帮助新手快速做出克隆
