一步实现单拷贝到高拷贝的转换－－CopyControl克隆技术（附图）

单拷贝克隆产量低，高拷贝克隆稳定性差，一直让研究者在克隆 表达时难以选择。蛋白的表达就有诱导表达系统，可以实现人为地控制蛋白的表达时间和表达量——现在连质粒的拷贝数可以借助诱导的方法来人为控制了！

Epicentre的专利技术——CopyControl克隆 系统能够让您共享单拷贝和高拷贝的优点。CopyControl克隆，首先以单拷贝形式生长——单拷贝可以确保插入稳定及成功克隆，编码毒性基因序列——在需要的时候，再诱导成高拷贝克隆，以便下游应用所需。

这一系统可以用来构建PCR克隆，对于BAC，fosmid文库等大型质粒格外有用。

一、CopyControl克隆系统有两个重要的成分：

（一）CopyControl pCC1 Vector.

这个载体含有两个复制起始位点：单拷贝的大肠杆菌F-因子复制子，和诱导型的高拷贝oriV。 OriV的启动，需要trfA基因产物，trfA基因既不在pCC1 Vector上，也不在其他常规用来克隆的大肠杆菌菌株中，这个基因由CopyControl 的第二个重要元件—— TransforMax EPI300 E.coli菌株提供。

（二）TransforMax EPI300 E.coli.

这是一个工程菌株，含有受诱导启动子严谨控制的trf A基因，在诱导表达的条件下可以提供启动oriV所需要的trf A基因产物。另外phage T1-resistant TransforMax EPI300-T1R E.Coli也可提供这个基因的产物。

二、CopyControl克隆和克隆诱导步骤：

2. 将目标DNA片断连接到已经线性化、去磷酸化的CopyControl pCC1 Vector上。

4. 转化感受态细胞（TransforMax EPI300 E.coli），涂皿，在氯霉素LB培养基上筛选。在这种条件下，trfA基因的表达被抑制，克隆 以单拷贝数量生长。

6. 挑选克隆 ，单个培养。

8. 加CopyControl诱导溶液到管中。诱导溶液诱导TransforMax EPI300 宿主细胞内trfA基因的表达，从而启动oriV，克隆 由单拷贝转化为高拷贝。

10. 用常规方法从诱导细胞内分离DNA。

这个系统用于常规PCR克隆 或者文库构建时，经过诱导，每个细胞中的质粒拷贝数可以从1个提高到200个，非常厉害，对于下游的表达或者核酸纯化、测序等都很有帮助。

而对于BAC和Fosmid等低拷贝的大型质粒来说，单拷贝的克隆 的稳定性是非常重要的考虑因素，经过诱导后每个细胞中质粒的拷贝数可以达到10—50个，对于后继的实验更有重要的意义。