大肠杆菌重组蛋白复性
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实验步骤
1) 取上述含目的蛋白菌液,4℃,6500 rpm 离心 15 min,弃上清;
2) 将沉淀完全重悬于 0.1 倍菌液体积的 1 × IB 洗涤液,反复混匀;
6) 弃上清,将沉淀(内有包涵体)用 0.1 倍菌液体积的 1 × IB 洗涤液完全重悬;
8) 将上述沉淀再次用 0.1 倍菌液体积的 1 × IB 洗涤液完全重悬,并将重悬液转移至重量已知的干净的离心管中;
9) 10000 rpm 离心 10 min 收集包涵体,弃上清,并将离心管倒置在纸巾上以完全除去多余的液体;
10) 离心管称重,减去管中以得到包涵体的净重。一般来说,OD600 为3 时收集的菌液,并且不溶性蛋白在细胞中的含量为 10-40% 时,每毫升菌液中有 1-4 mg 的包涵体。
1) 根据包涵体的重量计算所需的溶解液量,溶解包涵体使其在溶解液中的浓度为 10-20 mg/ml,溶解液按如下配方在室温下配制:
10 × IB Solubilization buffer 5 mL
2) 将配制的溶解液加入收集有包涵体的离心管中,轻微混和。大的片断用枪头反复打碎;
4) 室温 10000 rpm 离心 10 min 离心,转移上清(内有溶解蛋白)于干净的离心管中(避免碎片)。
ii. 在大体积的 2%(w/v)碳酸氢钠和 1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸10 min;
iv. 放在 1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸 10 min。冷却后,存放于4℃,必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋必须戴手套;
2) 准备透析液(为样品的 50 倍,如样品量为 15 mL,则需透析液 750 mL,因透析两次故共需透析液 1.5 L),按以下配方配制:
3) 4℃透析至少 3 h 以上,换新的透析液继续透析 3 h 以上;
1) 如上制备透析液,但加入氧化还原剂,于4℃保存(其中还原性谷胱甘肽和氧化性谷胱甘肽的浓度分别为 1 mM 和 0.2 mM);
4) 如有必要,继续于室温或37℃透析蛋白以提高二硫键的形成率。
另有一种替代的方法就是配制氧化性谷胱甘肽和还原性谷胱甘肽的浓缩液,并直接加到目标蛋白中,反应后透析再除去多余的氧化还原剂。
5. 阴离子交换树脂除去 N-lauroylsarcosine
5) 用尼龙膜(0.45-1 µm)过滤除去阴离子交换树脂;
6) 检测样品中 N-lauroylsarcosine 的含量,如有必要重复处理,检测方法如下:
i. 配制浓度为 0.3% 的 N-lauroylsarcosine 的储存液,并用 ddH2 O稀释至一系列的浓度梯度;
ii. 以同样的方法将待测蛋白样品用ddH2 O稀释,设置ddH2 O作为对照。每个样品稀释液的体积均为 0.5-1 mL;
iii. 每毫升稀释液中加入 100 µL 的浓度为 1 M 的 HCl;
v. 测定标准溶液的 OD405 并制作 N-lauroylsarcosine 的标准曲线,利用标准曲线对应确定待测样品中的 N-lauroylsarcosine;