DNA复性

DNA的复性指变性DNA 在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为" 退火"(annealing)。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成(见后)。DNA的复性不仅受温度影响,还受DNA自身特性等其它因素的影响。以下简要说明之。

 

温度和时间。变性DNA溶液在比Tm低25℃的温度下维持一段长时间,其吸光率会逐渐降低。将此DNA再加热,其变性曲线特征可以基本恢复到第一次变性曲线的图形。这表明复性是相当理想的。一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件,越远离此温度,复性速度就越慢。在很低的温度(如4℃以下)下,分子的热运动显著减弱互补链结合的机会自然大大减少。从热运动的角度考虑,维持在Tm以下较高温度,更有利于复性。复性时温度下降必须是一缓慢过程,若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4℃以下),复性几乎是及不可能的,核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性(单链)状态。这说明降温时间太短以及温差大均不利于复性。

 

DNA浓度。复性的第一步是两个单链分子间的相互作用“成核”。这一过程进行的速度与DNA浓度的平方成正比。即溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合“成核”的机会越大。

 

DNA顺序的复杂性。简单顺序的DNA分子,如多聚(A)和多聚(U)这二种单链序列复性时,互补碱基的配对较易实现。而顺序复杂的DNA,如小牛DNA的非重复部分,一般以单拷贝存在于基因组中,这种复杂特定序列要实现互补,显然要比上述简单序列困难得多。在核酸复性研究中,定义了一个Cot的术语,(Co为单链DNA的起始浓度,t是以秒为单位的时间),用以表示复性速度与DNA 顺序复杂性的关系。在探讨DNA顺序对复性速度的影响时,将温度、溶剂离子强度、核酸片段大小等其它影响因素均予以固定,以不同程度的核酸分子重缔合部分(在时间t时的复性率)取对数后对Cot作图,可以得到如图所示的曲线,用非重复碱基对数表示核酸分子的复杂性。如多聚(A)的复杂性为1,重复的(ATGC)n组成的多聚体的复杂性为4,分子长度是105核苷对的非重复DNA的复杂性为105。原核生物基因组均为非重复顺序,故以非重复核苷酸对表示的复杂性直接与基因组大小成正比,对于真核生物基因组中的非重复片段也是如此。在标准条件下(一般为0.18ml/L阳离子浓度,400核苷酸的长的片段)测得的复性率达0.5时的Cot值(称Cotl/2),与核苷酸对的复杂性成正比。对于原核生物核酸分子，此值可代表基因组的大小及基因组中核苷酸对的复杂程度。真核基因组中因含有许多不同程度的重复序列（repetitive sequence)，所得到的Cot曲线要S曲线复杂。