重组蛋白应用
近年来，重组蛋白的应用有了显著增长，与此同时，用于重组蛋白表达和纯化的技术和产品也得以增长。自从亲和标签融合技术出现以来，多种多样的短肽或蛋白亲和标签极大地方便了外源表达重组蛋白的分离与蛋白质复合体的纯化，已成为蛋白质研究领域不可或缺的工具。多聚组氨酸标签（His-tag）是目前高通量蛋白纯化最普遍使用的亲和标签，His 标签融合蛋白的固定化金属离子亲和层析（immobilized metal-ion affinity chromatography, IMAC）被作为主要的蛋白纯化方法。从重组蛋白的表达优化，到小量诱导纯化，再到中试、大规模生产需要众多繁琐、大量的工作。快速、可靠、高效的自动化分离分析技术可极大地提高效率，降低时间、人员成本。如何在高重现性的条件下，最小的人为干预的情况下，实现高通量、小规模蛋白生产和纯化成为关键，从而避免把时间浪费在反复摸索蛋白样品制备方案上。磁珠法（Magnetic Beads）、离心萃取法（Spin Column）以及重力柱法是常见的实验室蛋白纯化的方法，但这些方法有的通量较低、价格昂贵、不能反复清洗使用等缺点。
下面介绍一种利用枪头式分散固相萃取产品（MicroSep® Ni tips），进行 His 标签融合蛋白纯化的高通量自动化方法，该方法通过将松散的湿性填料与特制枪头式分散移液管相结合，构成枪头式分散固相微萃取柱，通过从枪头式分散固相微萃取柱底端吸入的方式，并可与自动移液工作站相结合，通过简单的吸打过程，完成 His 标签融合蛋白的结合、洗涤、洗脱过程，不需要振荡、离心等操作步骤，也不需要其他辅助仪器设备就可完成蛋白的纯化，达到快速纯化目标蛋白的目的。
图 1 MicroSep® Ni tips 结构图
MicroSep® Ni tips 利用分散固相萃取专利技术来富集 His 标签融合蛋白。分散技术有助于增强树脂与目标分析物结合，从而缩短孵育时间、简化处理过程。使用 MicroSep® Ni tips 通过简单的移液操作——吸液/分液即可完成对目标分析物的提取，结果一致性好、回收率高。
MicroSep® Ni tips 产品可与 Hamilton 、Integra 移液工作站配套使用。我们为用户提供自动纯化的应用程序包，并支持用户自定义工作流程。
图 2 Hamilton 自动移液工作站
图 3 Integra 自动移液工作站
His 标签融合蛋白纯化方法：
(1) 样品处理：将大肠杆菌菌液离心，弃去上清液，用结合缓冲液重悬菌体沉淀后，超声破碎菌体，离心后取上清液作为样品溶液；
(2) 预处理：取出枪头式分散固相微萃取柱，与移液器紧密结合后，吸入结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中金属离子树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打数次，最后排空弃掉全部的结合缓冲液；
(3) 样品吸附：用步骤 (2) 中预处理后的萃取柱吸入步骤 (1) 中准备的样品溶液，吸液过程中使微萃取柱中金属离子树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打数次，最后排空；
(4) 洗涤：继续吸入结合缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中金属离子树脂充分重悬，打出液体，如此反复吸打数次，最后排空弃掉结合缓冲液；
(5) 目的蛋白洗脱 ：一次或分多次吸入含磷酸钠，NaCl，咪唑的洗脱缓冲液，吸液过程中使微萃取柱中金属离子树脂充分悬浮，然后打出液体，如此反复吸打数次，最后将液体排出到干净的样品管中，即为纯化得到的蛋白溶液；
(6) 脱盐：步骤 (5) 纯化过的蛋白溶液可通过 MicroSep® Size X tips 产品进行高通量自动化脱盐。
图 4 MicroSep® Ni tips 纯化流程
推荐方案 1：利用 Hamilton Microlab 自动移液工作站及 1 mL / 300 µl MicroSep® Ni tips 枪头式分散固相微萃取柱对 His 标签融合蛋白的纯化。
Microlab® STAR 系列工作站是以液体处理为核心的生物医药实验室自动化操作平台的巅峰之作，拥有多项世界领先水平的专利技术，也是用户定制型自动化实验操作平台，可进行自动的加样、试剂分配、超微量移液，以及与液体处理相关的振荡、孵育等操作。如果整合第三方设备，可将整个实验流程实现全自动化。
Microlab® NIMBUS 是紧凑而灵活的小型自动化移液系统，它基于 Hamilton 优良的工作站传统，适用于小通量的应用。NIMBUS 高效率的台面设置提高了最快的速度、最高的吸头定位精度以及移液准确性。
图 5 Hamilton 结合 1 mL MicroSep® Ni tips 用户控制面板
优点：功能强大，高通量、实验流程全自动，结合 MicroSep® Ni tips 可完美解决医药研发等检测、分析、科研领域的各种 His 标签融合蛋白分离、提纯问题。
缺点：程序编制较复杂
推荐方案 2：利用 Integra Assist/Assist Plus 自动移液工作站及 1250 µL MicroSep® Ni tips 枪头式分散固相微萃取柱对 His 标签融合蛋白的纯化。
Integra Assist 可一次处理 1～12 个样品（Assist Plus 可适配可调间距移液枪），界面简单，可通过简单的操作将所需净化处理过程存储为程序方便重复使用。
图 6 Integra 结合 1250 µL MicroSep® Ni tips 纯化流程
优点：价格便宜，操作简便
缺点：处理样品相对较少；板位较少，可能需要人工加各步所需缓冲液
图片来源：微色谱
