【交流】重组蛋白A在免疫试剂应用中的新进展
丁香园论坛
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<center><strong><font>重组蛋白A在免疫试剂应用中的新进展</font></strong></center>
广州精达公司-美国免疫学博士 胡勇
摘要 抗体是免疫诊断试剂领域最重要的原料，蛋白A是纯化抗体最有效的工具，广泛用于免疫诊断试剂的许多领域。重组蛋白A具有产量大，成本低，纯度高，特异性好的优点。重组蛋白A的国产化将极大促进免疫诊断试剂的产品开发和市场效益。
关键词 抗体纯化 免疫诊断试剂 重组蛋白A 国产化
蛋白A（Protein A）为金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白，具有与人类和哺乳动物血液中免疫球蛋白IgG分子的Fc段特异性结合的能力，广泛应用于各种免疫诊断试剂的制备，包括抗体的检测和纯化、免疫细胞化学、病原体的快速诊断；蛋白A也可用于免疫吸附治疗领域。采用发酵、基因诱导、镍柱纯化生产的重组蛋白A使得其成本下降、纯度提高、特异性增强，已经成为免疫诊断试剂抗体制备中最重要的工具！目前，国外有2-3家蛋白A的产品在中国销售，但价格昂贵；国内已有数家公司开展了蛋白A 的克隆或表达，其中，广州精达公司采用美国克隆和生产工艺，顺利的完成了该种产品的国产化。
I、蛋白A的应用范围
1、用于抗体的检测和纯化 由于蛋白A与IgG具有特异性结合能力，70-80%的抗体纯化都采用了蛋白A亲和层析的方法，该方法已经成为抗体纯化的经典方法，在免疫诊断试剂小规模和工业大规模中都得到了良好的应用。该法具有非常高的选择性，一步亲和层析就可达到超过95%的纯度。
蛋白A纯化柱可与多种动物血清进行结合，用于多克隆抗体的纯化，包括人、兔和小鼠，（如表1所示）。蛋白A纯化柱用于人血清中IgG的浓缩，广泛用于标本的预处理；蛋白A纯化柱用于兔IgG的纯化，所纯化的抗体可广泛用于病理免疫组织化学，金标试纸条，ELISA的组装。除多克隆抗体之外，蛋白纯化柱也越来越多的应用于单克隆抗体的纯化，最早的单克隆抗体多为鼠源，而现在兔源性单克隆抗体因为亲和力高，更加广泛的被诊断试剂领域采用。而蛋白A纯化柱已经广泛的深入到上述两种单克隆抗体的常规纯化，同理，上述纯化产生的各种单克隆抗体可以用于ELISA，金标试纸条的组装，病理诊断试剂。
表1 不同物种来源的抗体与蛋白A亲和力~Kbr_~H~M~Kbr_~H~M__________________________________________~Ktable~M~Ktbody~M~Ktr~M~Ktd~M~8lt~Jcenter~8gt~J物种</center><center>与蛋白A亲和力</center> <center>人</center> <center>++++</center> <center>兔</center> <center>++++</center> <center>鼠</center> <center>++</center> <center>豚鼠</center> <center>+++</center> <center>马</center> <center>++</center> <center>猪</center> <center>+++</center>
值得一提的是，单克隆抗体药物已经跃升为最新型最重要的药品，全球市场的销售额每年达到200亿美金，因为是工业大规模生产的药物，所以对其纯度的要求特别高！据初步统计，全球已上市的单克隆抗体药物中，有超过一半的纯化都用到蛋白A亲和层析柱。用于纯化单克隆抗体的工业化生产的蛋白 A价值为每克500美金！
2、免疫细胞化学由于蛋白A具有双价结合力，既能不受种属特异性的限制与抗体结合，又能与多种报告分子（如酶标记、荧光染料、生物素、胶体金、放射性标记等）偶联，且这种偶联并不影响其与抗体的结合活性,因此,可作为标记抗体广泛应用于多种免疫细胞化学技术。采用辣根过氧化物酶标记蛋白A,通过ELISA实验可用于抗原或抗体的示踪、定位和定量,目前该方法己广泛用于如狂犬病抗体等多种疾病抗体的检测。采用荧光染料标记蛋白A,可用于微量蛋白的免疫荧光检测。
3、SPA的协同凝集剂 使用含蛋白A作为载体,结合特异性抗体作为协同凝集剂,可用于细菌、支原体和病毒等病原体的简易快速诊断、定群和分型。该方法具有快速、简便、可靠、不需要特殊仪器等优点,适用于流行病学调查和临床实验室检测致病菌。
4、免疫吸附治疗 免疫吸附治疗是利用免疫吸附剂与血浆中致病因子的抗体反应的亲和作用,通过血液体外循环的方式,高选择性地去除患者血液中的致病抗体,从而达到治疗的目的。由于蛋白A具有结合免疫球蛋白的能力,因此利用其为配基制备的免疫吸附剂被广泛用于自身免疫性疾病等的免疫吸附治疗。目前已经商品化的蛋白A吸附剂获得了美国食品和药物管理局(FDA)的认证,用于治疗特发性血小板减少性紫瘫和类风湿性关节炎(Prosorba)及带有抑制因子的血友病(linmunosorba)。在国内，蛋白A用于治疗系统性红斑狼疮、重症脂蛋白肾病、肾移植、多发性肌炎、重症肌无力和多发性硬化症。
II、重组蛋白A的优势
最早获得蛋白A的方法是从金黄色葡萄球菌中直接纯化获得,然而这种方法存在一些问题，例如：天然蛋白A只占菌体总蛋白的1.7%，难以满足大规模生产的需要，且金黄色葡萄球菌为致病菌，大规模生产危险性较大。为避免这些问题，目前人们采用基因工程技术来生产重组蛋白A，实现大规模生产蛋白A。
天然蛋白A分子按功能可分为3个部分（见图1）：
第一部分为信号肽（图1中S），含36个氨基酸，在蛋白质分泌中起作用；
第二部分为免疫球蛋白Fc段结合区（图1中E,D,A,B,C），共含291个氨基酸，按顺序分为E、D、A、B、C共 5个结构域，每个结构域都能与Fc段特异结合；
第三部分为胞壁结合区（图1中X），含182个氨基酸，与金黄色葡萄球菌胞壁的肽聚糖共价结合。
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蛋白A的功能是由其分子中第二部分（E,D,A,B,C）决定的，信号肽第一部分（S）在蛋白的分泌过程中被剪切掉，而约占分子的2/5大小的第三部分（X）则与其在免疫学方面的应用无关，应该利用重组技术切除掉，保证重组蛋白A能跟特异、有效地与IgG的Fc段结合。
重组蛋白A具有诸多的竞争优势：
1、极大的降低了成本：目前，采用基因工程技术和葡萄球菌A蛋白的基因克隆于大肠杆菌，通过大量发酵的方法，在诱导剂（IPTG）的作用下，可以诱导表达。大量的基因工程重组的蛋白A。另外，由于基因中含有8个组氨酸（His）的标签，镍柱纯化使得上述蛋白的纯化变得十分的简单，极大的降低了常规纯化蛋白中的成本，同时，也大大的提高了蛋白A的纯度，一步亲和层析就可达到95-98%的纯度。
2、增强了IgG的Fc段结合能力：通过基因的修饰，除去了蛋白中不与抗体Fc段结合的部分，增强了蛋白摩尔的结合能力，也去除了蛋白A中，与血清中杂蛋白的结合。
3、避免了葡萄球菌的污染：传统制备蛋白A的方法中需要大量培养葡萄球菌，而葡萄球菌又是一种可以污染环境、人体治病的微生物。在大规模的发酵、提纯过程中葡萄球菌不可避免造成环境的污染。采用现代基因工程的技术，避免葡萄球菌在储存、生产、发酵或纯化中的污染。
III、广州精达公司-重组蛋白A纯化柱
国外公司重组表达蛋白A的产品，由于垄断利率和进口中间商的操作成本，价格十分昂贵，价格高达2000元人民币！由于该种产品在免疫诊断试剂中，用量大，运用范围广，迫切需要国内自主研发独立生产的产品。
广州精达公司是由美国免疫学博士创立的生物医药公司，创立于2008年5月，注册资本1000万，位于广州科学城（网址：www.gendabiotech.com.cn tel:020-32219465），公司的状况可参见图2、图3. 公司拥有美国蛋白A的基因克隆，采用全套的美国生产工艺，包括细菌发酵、IPTG诱导、镍柱纯化。公司拥有成套生产重组蛋白A的发酵罐和大规模纯化生产。
<center>图2 广州精达公司现状</center><center> </center>
<center><strong> </strong></center><center><strong> 全自动发酵设备 分离纯化系统</strong></center><center>图3 广州精达公司现状</center><center> </center>
在获得重组蛋白A纯品之后，通过化学偶联的方法，将蛋白A结合到琼脂糖Sepharose CL-4B上，制备成蛋白A亲和层析柱。广州精达公司重组蛋白A纯化柱产品可参见图4。用户在使用重组蛋白A纯化柱时，血清样品中的抗体分子可以与蛋白A结合，而其他杂蛋白因为不能与蛋白A结合而穿过层析柱。结合在柱子上的IgG可以用酸洗或1M精氨酸洗脱使之解离，用收集管编号收集以达到纯化抗体IgG的目的。一般管中收集的IgG抗体用蛋白胶（SDS-PAGE电泳）进行检测，并判断IgG的纯度和浓度。
<center>图4 精达公司重组蛋白A纯化柱产品</center><center> </center>
图5为广州精达公司蛋白A层析柱纯化后所制备的蛋白胶（SDS-PAGE电泳胶）。图5中，经精达公司层析柱洗脱后，从第1管至第8管均有抗体的重链和轻链的带型。将上述有蛋白带型的管进行合并后测量抗体的浓度，广州精达公司蛋白A平均抗体IgG的载率为52mg/ml。
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上述IgG载率在诊断试剂及成本中有着十分重要的意义，众所周知，目前，大部分诊断试剂抗体原料都是由国外进口，价格在每毫克200美金到500美金不等。以每1ml柱子能多纯化12毫克的抗体计算，精达公司的产品多产生2400-6000美金的价值。以诊断试剂成品为计，（以ELISA为使用例子，每孔抗体包被浓度为2ug/ml），每毫克抗体则可以包被50个ELISA板，意味着：12毫克的抗体可以多包被600个ELISA板！由于金标试纸条的灵敏度比普通的ELISA低，所以使用抗体比ELISA更多，因而对于金标试纸条生产企业使用精达公司的Protein A层析柱将会产生更多更大的价值！
广州精达公司-美国免疫学博士 胡勇
摘要 抗体是免疫诊断试剂领域最重要的原料，蛋白A是纯化抗体最有效的工具，广泛用于免疫诊断试剂的许多领域。重组蛋白A具有产量大，成本低，纯度高，特异性好的优点。重组蛋白A的国产化将极大促进免疫诊断试剂的产品开发和市场效益。
关键词 抗体纯化 免疫诊断试剂 重组蛋白A 国产化
蛋白A（Protein A）为金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白，具有与人类和哺乳动物血液中免疫球蛋白IgG分子的Fc段特异性结合的能力，广泛应用于各种免疫诊断试剂的制备，包括抗体的检测和纯化、免疫细胞化学、病原体的快速诊断；蛋白A也可用于免疫吸附治疗领域。采用发酵、基因诱导、镍柱纯化生产的重组蛋白A使得其成本下降、纯度提高、特异性增强，已经成为免疫诊断试剂抗体制备中最重要的工具！目前，国外有2-3家蛋白A的产品在中国销售，但价格昂贵；国内已有数家公司开展了蛋白A 的克隆或表达，其中，广州精达公司采用美国克隆和生产工艺，顺利的完成了该种产品的国产化。
I、蛋白A的应用范围
1、用于抗体的检测和纯化 由于蛋白A与IgG具有特异性结合能力，70-80%的抗体纯化都采用了蛋白A亲和层析的方法，该方法已经成为抗体纯化的经典方法，在免疫诊断试剂小规模和工业大规模中都得到了良好的应用。该法具有非常高的选择性，一步亲和层析就可达到超过95%的纯度。
蛋白A纯化柱可与多种动物血清进行结合，用于多克隆抗体的纯化，包括人、兔和小鼠，（如表1所示）。蛋白A纯化柱用于人血清中IgG的浓缩，广泛用于标本的预处理；蛋白A纯化柱用于兔IgG的纯化，所纯化的抗体可广泛用于病理免疫组织化学，金标试纸条，ELISA的组装。除多克隆抗体之外，蛋白纯化柱也越来越多的应用于单克隆抗体的纯化，最早的单克隆抗体多为鼠源，而现在兔源性单克隆抗体因为亲和力高，更加广泛的被诊断试剂领域采用。而蛋白A纯化柱已经广泛的深入到上述两种单克隆抗体的常规纯化，同理，上述纯化产生的各种单克隆抗体可以用于ELISA，金标试纸条的组装，病理诊断试剂。
表1 不同物种来源的抗体与蛋白A亲和力~Kbr_~H~M~Kbr_~H~M__________________________________________~Ktable~M~Ktbody~M~Ktr~M~Ktd~M~8lt~Jcenter~8gt~J物种</center>
值得一提的是，单克隆抗体药物已经跃升为最新型最重要的药品，全球市场的销售额每年达到200亿美金，因为是工业大规模生产的药物，所以对其纯度的要求特别高！据初步统计，全球已上市的单克隆抗体药物中，有超过一半的纯化都用到蛋白A亲和层析柱。用于纯化单克隆抗体的工业化生产的蛋白 A价值为每克500美金！
2、免疫细胞化学由于蛋白A具有双价结合力，既能不受种属特异性的限制与抗体结合，又能与多种报告分子（如酶标记、荧光染料、生物素、胶体金、放射性标记等）偶联，且这种偶联并不影响其与抗体的结合活性,因此,可作为标记抗体广泛应用于多种免疫细胞化学技术。采用辣根过氧化物酶标记蛋白A,通过ELISA实验可用于抗原或抗体的示踪、定位和定量,目前该方法己广泛用于如狂犬病抗体等多种疾病抗体的检测。采用荧光染料标记蛋白A,可用于微量蛋白的免疫荧光检测。
3、SPA的协同凝集剂 使用含蛋白A作为载体,结合特异性抗体作为协同凝集剂,可用于细菌、支原体和病毒等病原体的简易快速诊断、定群和分型。该方法具有快速、简便、可靠、不需要特殊仪器等优点,适用于流行病学调查和临床实验室检测致病菌。
4、免疫吸附治疗 免疫吸附治疗是利用免疫吸附剂与血浆中致病因子的抗体反应的亲和作用,通过血液体外循环的方式,高选择性地去除患者血液中的致病抗体,从而达到治疗的目的。由于蛋白A具有结合免疫球蛋白的能力,因此利用其为配基制备的免疫吸附剂被广泛用于自身免疫性疾病等的免疫吸附治疗。目前已经商品化的蛋白A吸附剂获得了美国食品和药物管理局(FDA)的认证,用于治疗特发性血小板减少性紫瘫和类风湿性关节炎(Prosorba)及带有抑制因子的血友病(linmunosorba)。在国内，蛋白A用于治疗系统性红斑狼疮、重症脂蛋白肾病、肾移植、多发性肌炎、重症肌无力和多发性硬化症。
II、重组蛋白A的优势
最早获得蛋白A的方法是从金黄色葡萄球菌中直接纯化获得,然而这种方法存在一些问题，例如：天然蛋白A只占菌体总蛋白的1.7%，难以满足大规模生产的需要，且金黄色葡萄球菌为致病菌，大规模生产危险性较大。为避免这些问题，目前人们采用基因工程技术来生产重组蛋白A，实现大规模生产蛋白A。
天然蛋白A分子按功能可分为3个部分（见图1）：
第一部分为信号肽（图1中S），含36个氨基酸，在蛋白质分泌中起作用；
第二部分为免疫球蛋白Fc段结合区（图1中E,D,A,B,C），共含291个氨基酸，按顺序分为E、D、A、B、C共 5个结构域，每个结构域都能与Fc段特异结合；
第三部分为胞壁结合区（图1中X），含182个氨基酸，与金黄色葡萄球菌胞壁的肽聚糖共价结合。
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蛋白A的功能是由其分子中第二部分（E,D,A,B,C）决定的，信号肽第一部分（S）在蛋白的分泌过程中被剪切掉，而约占分子的2/5大小的第三部分（X）则与其在免疫学方面的应用无关，应该利用重组技术切除掉，保证重组蛋白A能跟特异、有效地与IgG的Fc段结合。
重组蛋白A具有诸多的竞争优势：
1、极大的降低了成本：目前，采用基因工程技术和葡萄球菌A蛋白的基因克隆于大肠杆菌，通过大量发酵的方法，在诱导剂（IPTG）的作用下，可以诱导表达。大量的基因工程重组的蛋白A。另外，由于基因中含有8个组氨酸（His）的标签，镍柱纯化使得上述蛋白的纯化变得十分的简单，极大的降低了常规纯化蛋白中的成本，同时，也大大的提高了蛋白A的纯度，一步亲和层析就可达到95-98%的纯度。
2、增强了IgG的Fc段结合能力：通过基因的修饰，除去了蛋白中不与抗体Fc段结合的部分，增强了蛋白摩尔的结合能力，也去除了蛋白A中，与血清中杂蛋白的结合。
3、避免了葡萄球菌的污染：传统制备蛋白A的方法中需要大量培养葡萄球菌，而葡萄球菌又是一种可以污染环境、人体治病的微生物。在大规模的发酵、提纯过程中葡萄球菌不可避免造成环境的污染。采用现代基因工程的技术，避免葡萄球菌在储存、生产、发酵或纯化中的污染。
III、广州精达公司-重组蛋白A纯化柱
国外公司重组表达蛋白A的产品，由于垄断利率和进口中间商的操作成本，价格十分昂贵，价格高达2000元人民币！由于该种产品在免疫诊断试剂中，用量大，运用范围广，迫切需要国内自主研发独立生产的产品。
广州精达公司是由美国免疫学博士创立的生物医药公司，创立于2008年5月，注册资本1000万，位于广州科学城（网址：www.gendabiotech.com.cn tel:020-32219465），公司的状况可参见图2、图3. 公司拥有美国蛋白A的基因克隆，采用全套的美国生产工艺，包括细菌发酵、IPTG诱导、镍柱纯化。公司拥有成套生产重组蛋白A的发酵罐和大规模纯化生产。
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在获得重组蛋白A纯品之后，通过化学偶联的方法，将蛋白A结合到琼脂糖Sepharose CL-4B上，制备成蛋白A亲和层析柱。广州精达公司重组蛋白A纯化柱产品可参见图4。用户在使用重组蛋白A纯化柱时，血清样品中的抗体分子可以与蛋白A结合，而其他杂蛋白因为不能与蛋白A结合而穿过层析柱。结合在柱子上的IgG可以用酸洗或1M精氨酸洗脱使之解离，用收集管编号收集以达到纯化抗体IgG的目的。一般管中收集的IgG抗体用蛋白胶（SDS-PAGE电泳）进行检测，并判断IgG的纯度和浓度。
<center>图4 精达公司重组蛋白A纯化柱产品</center><center> </center>
图5为广州精达公司蛋白A层析柱纯化后所制备的蛋白胶（SDS-PAGE电泳胶）。图5中，经精达公司层析柱洗脱后，从第1管至第8管均有抗体的重链和轻链的带型。将上述有蛋白带型的管进行合并后测量抗体的浓度，广州精达公司蛋白A平均抗体IgG的载率为52mg/ml。
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上述IgG载率在诊断试剂及成本中有着十分重要的意义，众所周知，目前，大部分诊断试剂抗体原料都是由国外进口，价格在每毫克200美金到500美金不等。以每1ml柱子能多纯化12毫克的抗体计算，精达公司的产品多产生2400-6000美金的价值。以诊断试剂成品为计，（以ELISA为使用例子，每孔抗体包被浓度为2ug/ml），每毫克抗体则可以包被50个ELISA板，意味着：12毫克的抗体可以多包被600个ELISA板！由于金标试纸条的灵敏度比普通的ELISA低，所以使用抗体比ELISA更多，因而对于金标试纸条生产企业使用精达公司的Protein A层析柱将会产生更多更大的价值！
