辅助方案2重组蛋白的代谢标记

由于重组蛋白表达的时候，宿主蛋白质的合成基本终止，因此体内代谢标记是检测重组蛋白的敏感方法。所有的标记氨基酸都掺入到晚期病毒特异的蛋白质（包括目的蛋白）的合成。³⁵S 标记的甲硫氨酸和半胱氨酸是常用的放射标记的氨基酸。为了获得更好的结果，在标记之前细胞内的这两种氨基酸应当被清除：将细胞在无甲硫氨酸和半胱氨酸的培养基中孵育 30 min 即可。掺入效率依赖于所感兴趣的特定蛋白质的甲硫氨酸和半胱氨酸的数量。标记后裂解细胞，蛋白质用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并用放射自显影显示。

1. 接种 2.5 × 10⁶ 细胞于盛有 3 ml 含 10 % 胎牛血清的 TNM - FH 培养基的 60 mm 组织培养皿中。对每一假定重组病毒分别制备一个培养皿供感染用，并制备一个对照培养皿供野生型杆状病毒感染。

2. 27℃ 温育 1 h，使细胞贴壁。吸出培养液，然后加入 1 ml 重组病毒或 1 ml 含野生型病毒的培养液，感染复数（MOI）为 5～10。室温温育 1 h。

3. 将每个培养皿中的培养液移去后，再往其中加入 3 ml 含 10% 胎牛血清的 TNM-FH 培养液，27℃ 温育 24～48 h。

4. 小心去除培养液，用不含甲硫氨酸或不含甲硫氨酸和半胱氨酸的培养液洗细胞 1 次，加入 1 ml 不含甲硫氨酸或不含甲硫氨酸和半胱氨酸的培养液，27℃ 温育 30 min，然后每个培养皿中添加 EXPRE³⁵S³⁵S 至 0.25～0.5 μCi。27°C 温育 3～4 h。

5. 将每个培养皿的细胞和培养物上清分别移至一支 15 ml 聚丙烯离心管，4°C 1000 g 离心 10 min。

6. 按照基本方案1，步骤 1.5～1.7 或 2.5～2.7，处理并分析细胞（非分泌型重组蛋白）或上清（分泌型重组蛋白）。如果有适用的抗体，建议将标记的裂解物先进行免疫沉淀，然后在 SDS 样品缓冲液中煮沸，并在SDS-PAGE 中分离。

7. 用放射自显影使蛋白质显迹。从放射自显影图查看感染了重组病毒，而不是野生型杆状病毒的细胞是否出现预期分子质量的蛋白质。

使培养皿倾斜，在一个角上移出和加入培养基以避免旋起单层细胞。