基本方案 小规模表达

分析方案依赖于表达蛋白的天然特性。

1. 如果目的蛋白为分泌性蛋白

1.1 用 3 ml TNM-FH/10%FBS 培养基将 2.5 × 10⁶ Sf9 细胞接种到 60 mm 组织培养皿中。27℃ 培养 1 h，使细胞牢固贴壁。每份需要检测的病毒储液制备一个培养皿，另一个培养皿作为无感染对照。

1.2 用新鲜的 3 ml TNM-FH/10% FBS 培养基更换培养基，接种 0.1 ml 高滴度的病毒储液到培养皿中，MOI 为 1～10。27℃ 培养 3 天。

1.3 收获培养皿中的细胞，并将细胞和培养基转移至 15 ml 聚苯乙烯离心管中。

1.4 4℃，1000 g 离心 10 min (用 GH-3. 7 转子 2000 r/min)。

1.5 将病毒上清转移到新管中。

1.6 用 Bradford 方法测定上清中的蛋白质含量，按步骤 7 进行分析。上清液可在 - 80 ℃ 保存数月。

1.7 按照下面的方法对样品中的蛋白质进行分析。

1.7.1 免疫印迹：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳每泳道中加入 20～40 μg 细胞总蛋白。注意要同时加入无病毒感染的细胞蛋白作为阴性对照。

1.7.2 . 考马斯亮蓝染色：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳每泳道中加入 20～40 μg 细胞总蛋白。如果重组病毒不纯，重组蛋白只有当其在感染细胞中有很高表达量时，才能被检测到。

1.7.3 功能分析：可以用任何一种典型的检测目的蛋白的方法，如 DNA 结合蛋白迁移率变动分析（针对 DNA 结合蛋白）、体外激酶分析（针对蛋白激酶）、 核苷结合分析（针对可以与核苷结合的蛋白质）或胸苷掺入分析（针对作为生长因子的蛋白质）。

1.7.4 重组蛋白的代谢标记。

如果没有简单的分析方法检测杆状病毒表达的重组蛋白，应检测假定的重组子中是否有外源基因 的存在。可以应用 Summers 和 Smith (1987) 提供的简便的点杂交方法；还可用 PCR 扩增。有一些公司（如 Invitrogen 和 Clontech）提供用于大多数杆状病毒载体的 PCR 引物。

1.8 通过上述实验，可以确定假定的重组病毒储液是否是可以生产目的蛋白的正确重组子。如果确定是正确的重组子，用噬斑试验纯化重组子，使之与污染的野生型病毒分离（如果不是使用线形杆状病毒 DNA 生产的）。制备大量病毒储液并测定重组病毒滴度。

2. 如果目的蛋白为非分泌性蛋白

2.1 用 3 ml TNM-FH/10%FBS 培养基将 2.5 × 10⁶ Sf9 细胞接种到 60 mm 组织培养皿中。27℃ 培养 1 h，使细胞牢固贴壁。每份需要检测的病毒储液制备一个培养皿，另一个培养皿作为无感染对照。

2.2 用新鲜的 3 ml TNM-FH/10% FBS 培养基更换培养基，接种 0.1 ml 高滴度的病毒储液到培养皿中，MOI 为 1～10。27℃ 培养 3 天。

2.3 收获培养皿中的细胞，并将细胞和培养基转移至 15 ml 聚苯乙烯离心管中。

2.4 4℃，1000 g 离心 10 min (用 GH-3. 7 转子 2000 r/min)。

2.5 弃上清。洗涤细胞，将细胞沉淀在 PBS 中重悬，按照步骤 4 离心，弃上清。

2.6 在每份沉淀中加入 500 μl 的 1 × SDS 样品缓冲液，置于沸水浴或 100℃ 加热板上加热 5～10 min。因为有 DNA 的存在，液体可能会黏稠，则需要超声样品，直到样品变清，用 Bradford 方法测定蛋白质含量。按步骤 7 进行分析。

此外，还可用 0.5 ml 适当的含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液（裂解缓冲液根据细胞类型的不同而 不同，昆虫细胞裂解液见附录 1)。6 × His 融合产物不能用含 EDTA 的裂解缓冲液。4℃ 离心 10 min 以澄清裂解液，将上清转移到新管中。100 μl 的裂解物中加入 100 μl 的 2 × SDS 样品缓冲液，沸水浴中加热 3 min。剩余裂解液可在 - 80℃ 保存数月。

2.7 按照下面的方法对样品中的蛋白质进行分析。

2.7.1 免疫印迹：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳每泳道中加入 20～40 μg 细胞总蛋白。注意要同时加入无病毒感染的细胞蛋白作为阴性对照。

2.7.2 . 考马斯亮蓝染色：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳每泳道中加入 20～40 μg 细胞总蛋白。如果重组病毒不纯，重组蛋白只有当其在感染细胞中有很高表达量时，才能被检测到。

2.7.3 功能分析：可以用任何一种典型的检测目的蛋白的方法，如 DNA 结合蛋白迁移率变动分析（针对 DNA 结合蛋白）、体外激酶分析（针对蛋白激酶）、 核苷结合分析（针对可以与核苷结合的蛋白质）或胸苷掺入分析（针对作为生长因子的蛋白质）。

2.7.4 重组蛋白的代谢标记。

如果没有简单的分析方法检测杆状病毒表达的重组蛋白，应检测假定的重组子中是否有外源基因 的存在。可以应用 Summers 和 Smith (1987) 提供的简便的点杂交方法；还可用 PCR 扩增。有一些公司（如 Invitrogen 和 Clontech）提供用于大多数杆状病毒载体的 PCR 引物。

2.8 通过上述实验，可以确定假定的重组病毒储液是否是可以生产目的蛋白的正确重组子。如果确定是正确的重组子，用噬斑试验纯化重组子，使之与污染的野生型病毒分离（如果不是使用线形杆状病毒 DNA 生产的）。制备大量病毒储液并测定重组病毒滴度。