杆状病毒系统蛋白质表达实验

实验分类：

蛋白质实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

在本方案中，用重组病毒储液感染 Sf 9 细胞，在感染后 2～3 天分析。分析方案依赖于表达蛋白的天然特性。本方案仅提供一些建议步骤，但不可能包括全部。根据表达蛋白的不同特性和已有的检测试剂，筛选步骤可做相应的改变。

内容来源于《精编分子生物学实验指南（第五版）》

来源：丁香实验

操作方法

基本方案小规模表达

1. 如果目的蛋白为分泌性蛋白1.1 用 3 ml TNM-FH/10%FBS 培养基将 2.5 × 106 Sf9 细胞接种到 60 mm 组织培养皿中。27℃ 培养 1 h，使细胞牢固贴壁。每份需要检测的病毒储液制备一个培养皿，另一个培养皿作为无感染对照。1.2 用新鲜的 3 ml TNM-FH/10% FBS 培养基更换培养基，接种 0.1 ml 高滴度的病毒储液到培养皿中，MOI 为 1～

辅助方案1 蛋白质生产高峰期的确定

1. 分别接种 3 × 105 细胞于 15 个盛有 3 ml 含 10% 胎牛血清的 TNM-FH 培养基的 60 mm 组织培养皿中。27℃ 温育 1 h，使细胞贴壁。然后每次均以感染复数（MOI）为 10 的量，用野生型病毒感染 7 个培养皿，用重组病毒感染 7 个培养皿，剩余的一个培养皿为非感染对照。另外，也可用 3 个 100 ml 旋转培养瓶悬浮培养 Sf 9 细胞。当细胞达到 1.5

辅助方案2重组蛋白的代谢标记

1. 接种 2.5 × 106 细胞于盛有 3 ml 含 10 % 胎牛血清的 TNM - FH 培养基的 60 mm 组织培养皿中。对每一假定重组病毒分别制备一个培养皿供感染用，并制备一个对照培养皿供野生型杆状病毒感染。2. 27℃ 温育 1 h，使细胞贴壁。吸出培养液，然后加入 1 ml 重组病毒或 1 ml 含野生型病毒的培养液，感染复数（MOI）为 5～10。室温温育 1 h。3. 将每个

基本方案2 重组蛋白大规模生产

1. 在悬浮培养液中培养 Sf 9 细胞，并使之适应无血清培养液（基本方案 1）。2. 准备旋转培养瓶，用于按比例扩增 Sf 9 细胞，将合适大小的两孔盖连接在转瓶的一个侧臂，另用一平盖接在另一侧臂（图 16.9.1）。将一段短管（约 15 cm）装在通气孔中，末端连接一滤器。借助张力器用管索将管子与通气孔和滤器加固。3. 将一段长管（30～60 cm）连接至进气孔，并在末端连接一滤器。用管索加固