包涵体蛋白质的溶解及复性实验

包涵体形成的原因比较复杂，至今尚不完全清楚。研究表明它的形成并非由于表达蛋白浓度超过溶解度造成的，链内二硫键的错配也不是它形成的主要原因。优势的观点认为：表达的外源蛋白缺少某些协助因子或因为局部微环境不适宜，不能正确地连续地形成次级键，经过多个中间折叠体最终形成天然三维结构。包涵体很可能就是表达蛋白不适当的中间折叠体高浓度积聚在一起形成的不溶物。它们不能进一步完成正确折叠成为天然结构 ，而是表达蛋白非天然形 式的混合物。包涵体有时在相差显微镜下可以直接观察到，位于大肠杆菌两端，呈深色的折光点，约 0.5 ～1 um。电镜易于观察和鉴定。

细胞
细胞裂解液 工作缓冲液
超声仪或玻璃珠研磨机

1. 包涵体检定

首先要检查总细胞抽提物中是否存在产物蛋白的高水平表达；其次要检查高水平表达的产物蛋白是否主要以不可溶的形式存在；最后要确定是否产物蛋白积聚形成包涵体。常采用的方法有电泳、免疫印迹、相差显微镜或电镜观察等。

2. 细胞裂解

2.1 选择裂解细胞的工作缓冲液，实验室常见的通用缓冲液是： 0.05 mol/L， pH 7.0 磷酸盐缓冲液，含 0.05 mol/L 氯化钠和 1 mol/L EDTA。在适量缓冲液内混悬细胞。

2.2 选用超声、玻璃珠研磨或溶菌酶处理等方法裂解细胞。建议此步骤适当加入蛋白酶抑制剂。

3. 包涵体分离

3.1 离心细胞裂解液，12 000 × g 4℃，5min。

3.2 将沉淀混悬在 9 倍体积含 0.5％ Triton X-100 的工作缓冲液内。室温孵育 5 min。

3.3 再次离心，12000 × g 4℃，5min。

4. 包涵体溶解

4.1 每克沉淀在 9 ml 含 8mol/L 脲 、2 mmol/L 还原型谷胱甘肽和 0.2 mmol/L 氧化型谷胱甘肽的工作缓冲液内混悬。请注意此时蛋白浓度应不超过 2.5 mg/ml，浓度过高不利于天然结构的形成。

4.2 将溶液在室温保留 60 min。

5. 复性

5.1 每毫升脲-蛋白溶解液缓慢加入 9 ml 含 2 mmol/L 还原型谷胱甘肽和 0.2 mmol/L 氧化型谷胱肽工作缓冲液。

5.2 室温孵育 2～4 h。

1. 一定要检测裂解液上清中的可溶产物蛋白。有时尽管形成包涵体，仍有一定量的可溶性产物蛋白。

2. 为监测细胞裂解的程度，裂解后应用相差显微镜进行检査。如有完整细胞将会随包涵体沉淀，从而降低包涵体蛋白的纯度，则需要进一步裂解。

3. 常用 6 mmol/L 盐酸胍替代 8mol/L 脲溶解包涵体。偶而，也用 1％ SDS 溶解包涵体，但在后面的步骤里较难除去。

4. 复性过程中，二硫键的变换也可以在碱性条件（pH 10.7） 溶解蛋白，然后用盐酸滴定至 pH 8.0 的方法 而不用谷胱甘肽等还原剂、氧化剂等。

5. 复性也可以通过加入伴侣分子、配体 、底物或辅基等获得较理想的结果。它们可能促进与天然结构密切相关的折叠中间体的稳定。

6.不同的包涵体蛋白有不同时最佳复性途径有时侧链化学修饰或加入蛋白沉淀剂也能帮助完成复性。