染色质免疫沉淀DNA分析
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实验步骤
2) 加入甘氨酸至终浓度为 125 mM，轻轻振荡孵育 5 分钟。
4) 用 5 ml 冷 PBS 刮下细胞，转移至一个 50 ml 离心管中。
5) 用 3 ml PBS 洗涤培养皿，收集剩余细胞至 50 ml 离心管中。
7) 小心吸弃上清液，用 FA 裂解缓冲液重悬沉淀（每 1 X 107 个细胞加 750 μl）。
1) 将裂解液超声处理以使DNA断裂成约 500-1000 bp 的片段。不同的细胞系需要不同的超声时间，因此需分别进行优化。
2) 超声处理后，4 °C，8000 g 离心 30 秒使细胞碎片沉淀。将上清液转移到新管中。此染色质溶液将用于步骤 4 的免疫沉淀 (IP)
3) 每个超声后的样本均取 50 μl，此样本为抽样样本，用于定量 DNA 浓度（见步骤 3），并作为 PCR 的对照样本。
1) 使用步骤 2.2 中得到的染色质溶液继续此操作。建议每个免疫沉淀反应 DNA 含量约为 25 μg 。每个样本用 RIPA 缓冲液 1:10 稀释。应设一个抗体对照和一个仅加磁珠的对照。
2) 除对照外，其余样本中均加入一抗。事先应通过预实验得到最佳的抗体加入量。一般来说，每 25 μg DNA 加入 1-10 μg 抗体。
3) 所有样本均加入 20 μl 的 A/G 蛋白磁珠（预吸附了单链鱼精 DNA 和牛血清白蛋白，见步骤 4.3a），进行免疫沉淀反应，4 °C 旋转过夜。
5) 将 A/G 蛋白磁珠离心，2000g 1 分钟，弃上清。
6) 用 1 ml 洗涤缓冲液洗涤磁珠 3 次。2000g 离心 1 分钟。
7) 用末次洗涤缓冲液洗 1 次。2000g 离心 1 分钟。
1) 洗提 DNA：向 A/G 蛋白磁珠中加入 120 μl 洗提缓冲液，30 °C 旋转 15 分钟。
2) 2000g 离心 1 分钟。将上清液转移至新管中。样本可于 -20 °C 保存。
3) 纯化 DNA 可用 PCR 纯化试剂盒（见步骤 3.2a）或酚:氯仿（加 280 μl 洗提缓冲液，然后参照步骤 3.2b）法进行。
4) DNA 可用实时 PCR 进行定量检测。可用实时 PCR 仪自带的软件进行引物和探针设计，或者使用在线设计工具进行设计。
