染色质免疫沉淀

染色质免疫沉淀法（chromatin immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。

真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。

ChIP利用抗原抗体反应的特异性，可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段的结合情况，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域、与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。

ChIP常用于研究转录因子（transcription factor，TF）与启动子（promoter）相互结合，研究组蛋白（Histone）的各种共价修饰与基因表达的关系等。

染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化，以及DNA的鉴定。

染色质免疫沉淀的基本原理是在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联、固定在一起，通过超声或酶处理将染色质随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。

用所要研究的目的蛋白特异性的抗体沉淀这种交联复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

器材：

①静音混合器

②高速低温离心机

③超声破碎仪

④电泳仪、水平电泳槽

⑤PCR仪

⑥Real-time PCR仪

试剂：

①材料：HeLa细胞

②HEPES

③NaCl、KOH、HCl、Triton X-100、NP-40、SDS、NaHCO₃

④去氧胆酸钠、EDTA、Tris

⑤蛋白酶抑制剂、蛋白酶 K、Protein A／Gbeads（鲑精DNA）

⑥对照引物（GAPDH）

⑦阳性对照抗体［乙酰化组蛋白H3抗体（Anti-Acetyl HistoneH3）］、阴性对照抗体［正常家兔IgG（Normal IgG）］

⑧琼脂糖

基本过程可分为如下几步：

（一）试剂配制

（1）裂解（FA Lysis）缓冲液 50 mmol／L HEPES-KOH,pH 7.5;140 mmol/L NaCl; 1 mmol/L EDTA, pH 8.0；1％ Triton X-100；0.1％ 去氧胆酸钠；0.1％ SDS；蛋白酶抑制剂（临用前加入）。

（2）RIPA缓冲液 50 mmol／L Tris-HCI，pH 8.0； 150 mmol/L NaCl；2 mmol/L EDTA,pH 8.0;1% NP- 40；0.5％ 去氧胆酸钠；0.1％ SDS；蛋白酶抑制剂（临用前加入）。

（3）漂洗（Wash）缓冲液 0.1％ SDS；1％ TritonX-100;2 mmol/L EDTA，pH 8.0;150 mmol/L NaCl; 20 mmol/L Tris-HCI，pH 8.0。

（4）最终漂洗（Final Wash）缓冲液 0.1％ SDS；1% Triton X-100;2 mmol/L EDTA,pH 8.0;500 mmol/L NaCl;20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0。

（二）细胞固定

（1）取一平皿细胞（150 mm平皿），细胞汇合度约80％～90％（HeLa细胞约1x10⁷个），平皿中含有培养基20 ml，加入550 μl 37％ 甲醛（或1100 μl 18.5％ 甲醛），使甲醛的终浓度为1％。

（2）温和混匀，室温孵育10 min。

（3）终止交联：加甘氨酸至终浓度为125 mmol／L，温和混匀，室温孵育5 min。

（4）将平皿置于冰上。

（5）吸尽培养基，用20 ml冰冷的PBS清洗细胞。

（6）吸尽PBS，重复清洗细胞1次。

（7）加入2 ml冰冷的PBS（含有1x蛋白酶抑制剂复合物），用细胞刮刀收集细胞，于1.5 ml离心管中。

（8）1000 g、4 ℃，离心5 min。

（9）吸去上清液，加入750 μl FA Lysis缓冲液，重悬细胞，得到细胞裂解液。

（三）染色质断裂

（1）将装有细胞裂解液的离心管置于冰上，进行超声破碎，超声功率为310 W，20 s冲击，2 s间隙，超声3次（根据不同的细胞株，不同的细胞数量超声的条件不同，需实验摸索），超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。

（2）超声破碎后，10000 g、4 ℃，离心10 min，去除细胞碎片等不溶物质。

（3）吸取上清液分装至新1.5 ml离心管中，每管50 μl（可于-80 ℃保存3个月）。

（4）可取100 μl超声破碎后产物，加入5 μl蛋白酶K（20 mg／ml），65 ℃，旋转混合，解交联4～5 h（或过夜），分出一半用酚-氯仿抽提，1.5 ％ 琼脂糖电泳检测超声效果。

（四）染色质免疫沉淀

（1）在每管50 μl超声破碎产物中加入450 μl RIPA缓冲液，为1：10比例稀释，留取5 μl（1％ 体积）作为Input对照，4 ℃保存至第4步操作（1）。

（2）加入抗体：每管样品中分别加入阳性对照抗体、阴性对照抗体（正常IgG）及目的蛋白抗体，抗体用量为1～10 μg。根据抗体效价、纯度及特异性，梯度稀释抗体，实验确定抗体用量。

（3）加入20 μl充分混匀的 Protein A／G beads（Salmon Sperm DNA）。

（4）4 ℃，旋转混合，1 h或过夜。

（5）2000 g，离心1 min，弃去上清液。

（6）清洗beads 3次，每次用1 ml Wash缓冲液，2000 g离心1 min，弃去上清液。

（7）清洗beads 1次，用1 ml Final Wash缓冲液，2000 g离心1 min，弃去上清液。

（五）解交联反应和DNA的纯化

用蛋白酶K，65 ℃保温4～5 h解交联，经DNA纯化柱回收DNA或用酚-氯仿抽提、乙醇沉淀纯化DNA。

（1）每份样品中均加入120 μl Elution 缓冲液（包括Input对照组），30 ℃，旋转混合，15 min。

（2）2000 g离心1 min。

（3）吸取上清液至一新的离心管中，可于-20 ℃保存。

（4）加入5 μl蛋白酶K（20 mg／ml），65 ℃，旋转混匀，解交联4～5 h（或过夜）。

（5）DNA用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，加100 μl水溶解DNA，可于-20 ℃保存。

（六）DNA的鉴定

最常用的DNA鉴定方法是半定量PCR和Real-time PCR。

（七）实验结果及分析

（1）交联后的染色质经超声波断裂，2％ 琼脂糖凝胶电泳分析结果，打断后的染色质片段的平均长度应该在200～1000 bp左右。

（1）甲醛交联反应时间根据细胞种类和细胞数量多少不同，需经预实验确定。

如果交联时间过长，则实验材料易丢失，且交联后的DNA-蛋白质复合体难以用超声打断；交联时间过短，则交联不完全。

（2）超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，使蛋白质变性，影响ChIP的效率，在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，超声时间也不要太长，以免蛋白降解。

（3）在做ChIP实验时，要做好实验对照，如果没有对照，很难对实验结果的可靠性进行评估。阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的实验对照。

同时要做好Input对照，Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率。

（4）染色质免疫沉淀所用目的蛋白抗体的选择是ChIP实验成功的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时，抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近，不能被抗体识别。

所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物，直接影响ChIP的结果，因此不是所有的抗体都能做ChIP实验的，只有经过ChIP实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性。