染色质免疫沉淀分析(ChIP)
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染色质免疫沉淀分析 (ChIP)
ChIP是目前确定与特定蛋白 结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法(图2―8)，也可用于分析与转录、有丝分裂或DNA损伤相关的发生改变的组蛋白修饰。ChIP技术和芯片技术的结合有利于确定全基因组范围内染色体蛋白的分布模式以及组蛋白修饰情况。该技术主要应用于：①组蛋白修饰研究；②转录调控分析；③药物开发研究；④有丝分裂研究；⑤DNA损失与凋亡分析。ChIP是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。
1．DNA剪切条件的优化
建立打断交联的DNA长度为200―1 000bp的实验条件。改变超声时电压设置，确保操作时，样品一直放在冰上，因为超声产生的热量会使DNA变性，通过电泳检测恢复交联后的超声DNA片段。
2．实验步骤
可采用Upstate公司的Chromatinlmmunoprecipitation(ChIPs)AssayKit进行操作。注意：步骤(3)～(7)应该置于冰浴中操作。
(1)处理10C1TI培养皿上1X10‘细胞，确保目的基因处于转录激活状态，同样处理另一个10cm培养皿用于细胞计数。
(2)将组蛋白与DNA相互交联，加入终浓度为1％甲醛到培养基上，37℃孵育10min。
(3)尽可能的吸去培养液，用含有蛋白酶抑制剂的冷PBS洗两次。
(4)将细胞刮人锥形管中。
(5)4℃，2 000r／min离心4min。将SDS裂解液放置室温，使SDS溶解，并加入蛋白酶抑制剂。
(6)将细胞沉淀加入200／llSDS裂解液，冰上孵育10min(200／ul SDS裂解液是对于1X106 细胞，如果有更多的细胞，要相应增加SDS裂解液的用量)。
(7)将DNA用超声打断，DNA片段长度为200―1 000bp，应在冰浴中操作，同通过优化超声的条件，使DNA片段长度保持在200―1 000bp之间。
(8)加人8u1 5mol／LNaCl，65℃，4h，解交联。
(9)通过酚―氯仿提取DNA，并用含有溴化乙啶的2％琼脂糖凝胶电泳，观察超声打断DNA的效率。
3．染色质免疫沉淀分析
如果超声条件通过上述实验得到优化，可以在完成上述(1)一(7)步后，进行下面的实验。对于阴性对照，可以采用非抗体免疫沉淀对照，另外也要采用非激活的样品作为PCR部分的对照。
(1)将所得样品4C，13 000 r／rain离心10 min，加入200／11超声过的细胞上清液到2ml的离心管中，弃掉沉淀。
(2)将超声过的细胞上清液用10倍的ChIP稀释缓冲液稀释。
(3)为了减少非特异性背景，在2ml的细胞上清液中加入80ul鱼精DNA／50％蛋白A琼脂糖混合物，在4~C震荡30min，增加孵育时间，可以进一步减少非特异性结合。
(4)通过短暂离心，沉淀琼脂糖，并收集上清液部分。
(5)加入免疫沉淀的抗体到2ml的上清液部分，在4~C震荡孵育过夜。对于阴性对照，在上清液中加入60ul鱼精DNA／50％蛋白A琼脂糖混合物，4~C震荡1h，继续上述(7)步骤。
(6)加入60ul鱼精DNA／50％蛋白A琼脂糖混合物，4~C震荡1h，以结合抗体／组蛋白复合物。
(7)轻微离心沉淀琼脂糖(700―1 000r／min，4~C，1min)，弃掉含有未结合的非特异性DNA，用下面的液体1m1在翻转板上依次洗蛋白A琼脂糖／抗体／组蛋白复合物3～5rain。
经过上述处理后的样品为蛋白A琼脂糖／抗体／组蛋白复合物，可以用于免疫共沉淀／免疫印迹或PCR分析。
