冷冻蚀刻免疫电镜技术

互联网2013-11-13

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实验原理

冷冻蚀刻法(Freeze Ftching)，也称冷冻复型法(Freeze Replica)或冷冻切断(Freeze Fracture)，是研究生物膜结构的重要方法之一。其主要步骤首先是将样品在液氮中冷冻，然后放到真空喷镀仪中切断，切断后的切面上有细胞器，其间还有冻成洋的水分。再加热使冰升华，将水份蒸发，把细胞器的膜结构暴露出来，这一步骤就称为冷冻蚀刻。如不进行蚀刻就称为冷冻切断。向暴露的膜结构上喷镀铂—碳投影，再喷碳来加固。这样就在切断的样品表面形成一层复型膜。在此复型膜上印下了细胞切面的立体结构。从真空中取出样品，把复型膜下面的组织腐蚀掉，再把复型膜捞在铜网上，在透射电镜下观察复型膜。

关于生物膜的分子结构，目前被大家公认的并为冷冻复型电镜观察所证实的是流动镶嵌型，即脂质—球状蛋白质镶嵌模型。依照这上模型学说表明，生物膜是一种流动的、可塑的、镶嵌蛋白质分子的脂质双分子层的膜；脂质双分子层中每一分子分别具有两极，一端为亲水极，朝向膜的内、外表面，而另一端的疏水极朝向膜的中线部位，两排分子彼此相对，构成生物膜膜性结构的基础。蛋白质分子彼此相对有嵌入性和表在性两种，前者大约占蛋白质总量的3/4左右，外形近似球状，镶嵌在脂质分子层的不同深度内，而后者则大多附着于细胞膜的胞质面。在冷冻劈裂后，生物膜的水平断面大多发生在单位膜的疏水极。因此，膜的亲水部，分别命名为PS(与细胞质，核质或线粒体内基质相邻的面)和ES(与细胞外间隙或细胞内间隙或细胞内间隙相邻的面，如内质网腔、核质间隙、线粒体内、外膜之间的腔和其它各种泡的腔等)。膜的疏水部、亦即劈裂面分别叫做EF(面向细胞质、核质、或线粒体基质的面)和PF(向细胞外间隙或内间隙的面)。从70年代初期开始，冷冻蚀刻免疫电镜技术已开始在应用，但由于免疫标记必须在冷冻蚀刻步骤以前进行，所以仅能标记细胞外表面(ES)。80年代开始建立了断裂—标记细胞化学方法，将细胞膜劈开后，中央的两侧断面(EF与PF)以及各种细胞器的膜的各个表面及细胞质与核质都能被标记，为此技术的广泛应用创造了条件。应用此法还可对抗原与受体分子进行定量统计。

实验步骤

1. 冷冻蚀刻表面标记免疫电镜技术

1) 新鲜或固定的细胞进行直接法或间接法免疫标记。

2) PBS(pH7.5)冲洗3min×2，加入1mmol/l MgCl₂ 蒸馏水洗洗3min×3，离心沉集细胞。

3) 将细胞团置于小纸板上，入液氮冷却的Freon中，取出入冷冻蚀刻仪中进行断裂操作，再于-100℃蚀刻1min 。

4) 制做断裂面复型。

5) 再次氯酸钠清洗复型，蒸馏水洗后进行观察。

本法可显示断裂暴露的PF位于中央，周围则是蚀刻后露出来的ES，标记物只出现在ES上。

2．断裂—标记免疫电镜技术

此法是先进行冷冻断裂，再做免疫标记，从而可以对断裂开的各种膜结构及胞浆断面进行标记。

1) 临界点干燥法

a. 固定：1.0%～2.5%戊二醛PBS液4℃1～2h，PBS冲洗3min×3。

如为细胞悬液，可加入30%BSA后加入1%戊二醛，使BSA凝胶化，将凝胶切成2mm左右的小块，用30%的甘油—PBS浸透后置于用液氮冷却的Freon中冷却。

b. 冷冻断裂，将冰冻的凝胶小块放在盛有液氮的培养皿中，培养皿放置于二氧化碳—液氮槽中，用预冷的解剖刀切割凝胶小块进行冷冻断裂。

c. 解冻，置碎块于30%甘油—1%戊二醛磷酸缓冲液中解冻。

d. 置换甘油，放入1mmol/l 氨基乙酰甘氨酸磷酸液去甘油，PBS冲洗，3min×2。

e. 免疫标记。

f. 1%锇酸，室温固定30min。

g. 系列梯度乙醇脱水，临界点干燥，喷镀铂—碳膜，次氯酸钠清洗复型，蒸馏水洗，捞于有Formvar膜铜网上透射电镜观察。

2) 超薄切片法

步骤：a至e同临界点干燥法。

f. 1%锇酸，室温固定2h，系列酒精或丙酮脱水，常规电镜包埋。

g. 切半薄片，光镜定位合适的断裂部位，再切超薄切片，铀铅染色，透射电镜观察。

断裂标记法目前文献报告应用较多的是植物凝集素—胶体金免疫标记技术，常用的如刀豆球蛋白(Con A)-- 胶体金免疫标记技术，Con A能与细胞膜中的甘露糖结合，能标记内质网膜、核被膜以及细胞膜的EF面，有助于糖蛋白在超微结构水平的定位。

为保证实验结果的准确性，每组实验在免疫标记阶段应设立对照组。