铁蛋白免疫电镜技术

1.  铁蛋白的提取

（1） 配制2%硫酸铵液，并以1 mol/L的NaOH或HCl调pH值，正好为5.85。取1 g铁蛋白溶于100 ml的2%硫酸铵液中。

（2） 加入20%硫酸镉，使最终浓度为5%，混匀，4℃过夜。

（3）1 500 g离心(4℃)2 h，去上清。仍加2%硫酸铵至100 ml，混匀，离心，去除不纯沉渣。

（4）于上清液中重新加入20%硫酸镉，重复步骤⑵，离心，去上清。

（5） 检查沉渣，置显微镜下检查，应具有典型的黄褐色结晶，结晶为六角形，双一四点结构，如结晶不典型，应继续重复以上步骤。

（6）以少量的蒸馏水溶解，再加50%饱和硫酸铵溶液，使之沉淀，离心，去上清。

（7）重复步骤⑹一次。

（8） 以少量蒸馏水溶解，常水透析24 h后，以0.05 mol/L pH7.5 PBS透析24 h。

（9） 100 000 r/min离心2 h，去除上部无色上清液(约3/4总量)，置4℃过夜。

（10）用微孔滤膜(孔径0.45 μm)过滤，使铁蛋白含量为65 mg/ml～75 mg/ml，分装，4℃保存。

2.  铁蛋白－抗体交联

（1） 以0.3 mol/L pH9.5硼酸盐缓冲液将铁蛋白稀释成20 mg/ml～25 mg/ml。

（2）以1︰1 000(W/W)的比例加入XC液室温搅拌45 min，离心去沉淀。

（3） 以0.3 mol/L pH9.5硼酸盐缓冲液将提纯lgG配成5 mg/ml，以1︰4的比例(V/V)加入IgG与铁蛋白－XC液，4℃搅拌48 h。

（4）以0.1 mol/L碳酸铵溶液透析过夜，以除去多余的异氰酸盐，再以0.05 mol/l pH7.5 PBS透析，使pH值恢复到生理水平。

（5） 超速离心  以1.00×105 g离心5 h，去上清，沉淀以0.05 mol/L PBS悬浮，再次离心，以除去未结合的IgG。

（6） 以血清学及免疫学方法测定结合抗体的特异性、免疫活性以及标记效应。

3.  铁蛋白－抗体结合物处理标本

（1） 将标本以5%福尔马林pH7.2(4℃)PBS液固定40 min～60 min。

（2） 用冷的PBS液洗涤，离心。

（3） 如是组织块，则在解剖显微镜下切成更小块，放入试管中，加入铁蛋白－抗体结合物置室温20 min，不时振荡。

（4） 以冷PBS液洗涤三次，离心。

（5） 沉淀以2.5%戊二醛固定20 min，以PBS洗涤。

（6） 再以锇酸固定，脱水包埋。

也可以先超薄切片，再进行铁蛋白－抗体结合物染色。操作如下：

（1） 将培养细胞以1%福尔马林PBS液固定(4℃)。

（2）PBS液洗涤离心。

（3） 以0.5 ml，30%牛血清蛋白PBS液悬浮置入胶透析膜袋中，再将袋置于吸水剂粉末上，待牛血清白蛋白成胶状物时，将透析袋移至2%戊二醛PBS液（pH7.5）中固定3 h。

（4）取出，切成小块，以PBS液洗涤。

（5） 置干燥器中以硅胶干燥。

（6） 包埋、切片、在水上收集切片置于经4%牛血清白蛋白PBS液处理的披有胶膜的载网上(牛血清白蛋白的处理在于减少铁蛋白结合物非特异性吸附于载网上)。

（7） 滴一滴铁蛋白－抗体结合物于载网上。

（8） 5 min后，浮网于PBS液面,标本面向下，以除去多余的结合物。

（9）凉干后，滴一滴乙酸双氧铀或氢氧化铅以复染。水洗、晾干、电镜观察。

三、结果判定

在已知对照样品成立的前提下，凡是出现黑色的铁分子颗粒即表示抗原的存在，判定阳性(＋)，否则判为阴性(－)。