冷冻蚀刻技术介绍

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1、简介

冷冻蚀刻(freeze-etching)技术是在冷冻断裂技术的基础上发展起来的更复杂的复型技术。如果将冷冻断裂的样品的温度稍微升高，让样品中的干冰在真空中升华，而在表面上浮雕出细胞膜 的超微结构。当大量的干冰升华之后，对浮雕表面进行铂一碳复型，并在腐蚀性溶液中除去生物材料，复型经重蒸水多次清洗后，捞在载网上作电镜观察。

2、技术优点

冷冻蚀刻(Freezeetching)技术是从50年代开始发展起来的一种将断裂和复型相结合的制备透射电镜样品技术，故而亦称冷冻断裂(Freezefracture)或冷冻复型(Freezereplica)。

它的优点在于：

①样品通过冷冻，可使其微细结构接近于活体状态;

②样品经冷冻断裂蚀刻后，能够观察到不同劈裂面的微细结构，进而可研究细胞内的膜性结构及内含物结构;

③冷冻蚀刻的样品，经铂、碳喷镀而制备的复型膜，具有很强的立体感且能耐受电子束轰击和长期保存。

3、技术缺点

它的缺点是：冷冻也可造成样品的人为损伤;断裂面多产生在样品结构最脆弱的部位，无法有目的地选择。

4、操作方法

1.预处理取新鲜组织块，大小为1?5～3～5mm，用2?5%戊二醛固定1～3小时。为防止冰晶形成，用30%甘油生理盐水浸泡8～12小时。

2.冷冻断裂是在冷冻条件下使样品变得又硬又脆，用刀劈裂样品，暴露观察面。因为是用刀劈裂的样品，断裂往往发生在细胞被冻结后较脆弱的部位，多数是沿细胞及细胞器 的膜裂开。由于断裂面是凸凹不平的，所以图像立体感强。冷冻断裂时，刀的作用在于劈裂，而不是切割，所以刀刃不必锋利，但不能有缺口、油污和水份，还需保持清洁干燥。冷冻复型的断裂操作要在真空中进行，是因为真空对热传导性差，能使样品较长时间维持在较恒定温度下进行断裂操作，同时也便于进行下步的蚀刻处理。