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快速高效的半定量活性转录因子检测方法

中帜生物

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转录因子作为一种调控基因表达的关键蛋白,在很多研究中都是需要重点监测的对象。特别是对具有活性的转录因子的检测,有着重要的意义。

转录因子的一个重要特点是在经过翻译后修饰及其它一些变化以后才具有发挥功能的活性。传统的测方法,如ELISA、Western Blot、荧光定量PCR等,都不能区分活化与未活化的转录因子,限制了这些方法在转录因子检测方面的应用。目前比较常用的是基于转录因子与特定DNA序列结合原理的凝胶迁移实验(EMSA),可以对样本中具有活性的转录因子进行定性检测。同时,凝胶迁移实验需要制胶、跑胶、转膜、检测等步骤,操作稍显繁琐;特别是在样本量较大的时候,更显得力不从心。

为了解决这些转录因子检测中的问题,美国Signosis开发出了一种快速高效的半定量活性转录因子检测方法——滤板法。这种方法同样基于转录因子与特定DNA序列结合的原理,以标准96孔板为载体进行实验操作。针对不同的转录因子设计特异性的生物素标记DNA探针,探针与样本核提取物中相应的转录因子结合形成TF/DNA复合物。用滤板除去游离的DNA探针,随后从滤板上洗脱并收集TF/DNA复合物中的DNA探针。用标准96孔板对捕获收集到的DNA探针,通过辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素检测,在化学发光仪上读取发光度值(RLUs)。



这种方法主要有三大优势:
1、操作简单。整个实验操作过程类似于ELISA实验,操作简单,无需特殊设备。
2、高效,性价比高。一块标准96孔板上可以同时进行96个样本中的一种转录因子检测,通过对探针的组合使用,还可以选择检测48个样本中的两种转录因子、32个样本中的三种转录因子或者24个样本中的四种转录因子。
3、结果数值化呈现,判断更加客观,同时方便进行样本之间的比较及半定量分析。
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