转录因子活性芯片

转录因子活性芯片

 

    真核基因 的表达是由转录因子调控的。通过与存在于某些基因启动子上的特异DNA结合因子的相互作用，转录因子调节转录起始的频率。转录因子的表达或活性可以受细胞类型、组织特异性以及细胞周期的调节，这种调节也可以通过与其他蛋白质相互作用而实现。通过把这些调节机制的不同整合・，真核生物可以激发无数的基因表达模式。要充分了解基因表达是如何调节的，关键是对转录因子的DNA结合活性进行分析。

    蛋白质／DNA芯片使得对真核生物转录因子的功能分析更加简单化。这种以芯片为基础的技术比繁琐的凝胶迁移试验有很大的改进，它能同时检测多个转录因子的活性，而凝胶迁移试验一次只能分析单个转录因子活性。转录因子活性芯片可以同时研究54种或345种转录因子在细胞增殖、分化、转化、凋亡以及药物处理中DNA结合活性改变。现在有很多商业公司提供的蛋白质／DNA芯片，芯片上每一种consensus序列都对应一个特异的转录因子，这些转录因子的性质比较清楚，而且有很多已发表的文章可以参考。我们仅以康成生物TranSignalTM蛋白质／DNA芯片为例作介绍。

    1．转录因子活性芯片的优点

    (1)高效：能同时分析多种转录因子。

    (2)简便：无需额外仪器。

    (3)安全：无放射性。

    (4)高灵敏性：采用改良的基于HRP的化学发光检测

    2．实验的基本步骤(图2―9)

    1)核蛋白抽提

    (1)实验对象为细胞样品：每份样品取1X10’细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1 m1BufferA混合液破碎细胞膜，离心收集细胞核，加150ulBufferB混合液裂解细胞核，抽提核蛋白并定量。

    (2)实验对象为组织样品：取500／Jg新鲜组织样品或正确保存的组织样品，切成小块放人管中，加1．5m1BufferA混合液匀浆，离心收集细胞核。加150ul BufferB混合液裂解细胞核，抽提核蛋白并定量。

    2)制备转录因子结合探针：①TranSignal探针混合物与核蛋白孵育，核蛋白抽提物中有活性的转录因子，与相应的探针结合形成复合物；②分离纯化复合物；③洗脱探针并收集探针。

    3)芯片与探针杂交：使用实验中心优化的缓冲液和实验方法将收集的探针与所选择的转录因子芯片杂交。

转录因子芯片操作流程图

    4)化学发光检测：探针与芯片杂交后，加HRP标记的链亲和素抗体与化学发光底物反应。X线胶片曝光在胶片上显示检测结果。

    5)图像采集与数据分析：①通过X线胶片曝光，调整曝光时间使大多数点有相同的信号强度。②将胶片上的图像用扫描仪扫描，并转换为灰度TIFF格式的图片文件保存。运行ScanAlyze软件，将灰度TIFF格式图片的点阵转化为数字型数据，将此原始数据储存为MicrosoftExcel文件。③任何点有2倍增强或减弱都认为是有意义的，当然还需通过EMSA或荧光素酶报告分析(1uciferasereporterassay)验证。

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