高效液相色谱―电喷雾串联质谱法测定水产品中红霉素的残留

　　【摘要】建立了高效液相色谱�电喷雾串联质谱法测定水产品中红霉素残留量的方法。以红霉素同位素标记物（Erythromycin, N，N�Dimethyl�13C2）为内标，样品用乙腈提取，经正己烷去脂、HLB固相萃取柱净化后，内标法定量。红霉素在添加浓度1.0～20.0 μg/kg范围内，回收率为87.0%～97.8%；日内精密度为3.2%～9.2%；日间精密度为1.3%～4.8%；方法线性范围为1.0～100 μg/L；检出限为1.0 μg/kg。

　　【关键词】 高效液相色谱 串联质谱 水产品 红霉素 残留

　　1 引言

　　红霉素（Erythromycin A）属大环内脂类抗生素，对葡萄球菌、各种链球菌和革兰阳性杆菌均具有抗菌活性，应用非常广泛。红霉素在养殖业（畜禽、水产品）中主要用于细菌性疾病的治疗与防治。由于红霉素在动物体内代谢时间较长，因此不可避免地残留在动物体内，给食品安全带来危害。目前世界各国为保证食品安全，对红霉素的使用和红霉素在食品中的残留限量进行了规定，我国农业部235号公告[1]和欧盟EC 1181/2002[2]中规定红霉素在动物组织中最大残留限量为200 μg/kg。

　　有关食品中红霉素残留的测定，主要有液相色谱�荧光法[3,4]、液相色谱�电化学法[5,6]和液相色谱�质谱法[5，7～1３]。液相色谱�质谱法是目前测定食品中红霉素残留的最佳方法，但这些方法不适合于水产品中红霉素残留量的测定，其原因是：一些方法[3，4，7～1０] 以竹桃霉素或罗红霉素为内标物测定食品中红霉素的残留，由于竹桃霉素和罗红霉素是兽药，在水产品养殖过程中一旦使用该种药物，会影响红霉素的测定。另外一些方法[6,1１，12] 采用外标法对红霉素进行定量分析。但研究发现，红霉素不稳定，在样品处理过程中发生分解，导致回收率低（＜60%），所以用外标法测定红霉素准确度不高，不能满足国际上药物残留检测的要求。Lucchetti等[13]以红霉素同位素标记物(erythromycin, N，N�Dimethyl�13C2)为内标物，样品用乙腈提取、正己烷净化的方法测定虹鳟鱼中红霉素的残留。该方法解决了上述方法中存在的定量问题，检出限为50 μg/kg。由于该方法样品前处理的局限性，使其在用于测定色素和脂肪含量很高的水产品如虾和蟹中红霉素的残留时，因杂质多、基质干扰较大，影响了红霉素分析的准确性。另外该方法为降低本底干扰，取样量极少（约0.1 g/mL），因此灵敏度较低。本实验以红霉素�13C2为内标物，在液相色谱�串联质谱测定的基础上，重点进行了样品前处理方法的研究，提出了乙腈提取，正己烷多次净化和C18固相萃取柱净化相结合的样品前处理方法，本方法消除了本底干扰，提高了灵敏度，方法检出限达1.0 μg/kg。本方法已被推荐为水产行业红霉素残留检测标准。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　TSQ QUANTUMN ACESSES 高效液相色谱�质谱联用仪（赛默飞世尔科技有限公司）;TD5A�WS离心机(上海湘仪离心机厂);均质机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）;旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）;固相萃取装置(Supleco公司)。

　　红霉素A（纯度≥95%，Dr.Ehrenstorfer Gmbh）;红霉素�13C2（erythromycin A, N，N�Dimethyl�13C2，纯度≥95%，美国剑桥研究所）。乙腈、甲醇（液相色谱纯，Sigma公司）；正己烷、Na2HPO4（分析纯，上海国药公司）；乙酸（液相色谱纯，Sigma公司）；Oasis HLB固相萃取柱（500 mg/6 mL，Waters公司）；使用前分别用10 mL甲醇、10 mL水、5 mL 2% NaCl和5 mL 0.1 mol/L Na2HPO4（pH=8）活化，保持柱体湿润。

　　红霉素和红霉素�13C2标准储备液：分别准确称取红霉素和红霉素�13C2 10.0 mg，用甲醇溶解并分别定容至100 mL； 1 mg/L红霉素标准溶液：准确吸取0.5 mL红霉素标准储备液，用甲醇稀释至50 mL； 红霉素内标工作液：准确吸取适量红霉素�13C2标准储备液，用甲醇逐级稀释配成100 μg/L的内标工作液。

　　2.2 样品处理方法

　　2.2.1 制样 鱼，去鳞、去皮，沿脊背取肌肉；虾，去头、去壳，取肌肉部分；河蟹取可食部分；用均质机将其搅碎，并充分混匀。

　　2.2.2 提取和去脂 称取均质样品5．００ g置于50 mL离心管中，加入100 μL内标工作液和15 mL乙腈，立即搅拌、将其分散开，超声提取5 min，震荡提取5 min，以4000 r/min 离心10 min，将上清液移入另一个50 mL离心管中，加入2.0 g NaCl和15 mL 正己烷，震荡10 min，以4000 r/min 离心10 min，弃去正己烷，取出约12 mL 乙腈于100 mL 梨形瓶中， 35 ℃减压蒸干。向梨形瓶中加入7 mL 0.1 mol/L Na2HPO4缓冲溶液，使残渣充分溶解，然后加入4 mL的正己烷，混合1 min，将溶液倒入离心管中，以6000 r/min离心5 min，弃去正己烷层，下层溶液再加4 mL的正己烷，按上法重复操作一次。

　　2.2.3 净化 将2.2.2中的Na2HPO3缓冲溶液加入到固相萃取柱中，用5 mL磷酸盐缓冲溶液清洗离心管，并将溶液加入柱中，待样液全部流出后，分别用10 mL 水和5 mL 40%甲醇�水溶液洗柱，弃去全部流出液，固相萃取柱用真空泵抽干，用8 mL甲醇洗脱，洗脱液接收至100 mL 梨形瓶中，35 ℃减压蒸干。用1 mL 30%甲醇�水溶液溶解残渣，用0.22 μm 过滤膜过滤后，供液相色谱�串联质谱测定。

　　2.3 液相色谱�质谱分析条件

　　液相色谱条件：Thermo HypersilGOLD C18色谱柱(150 mm ×2.1 mm i.d.，3.5 μm）；柱温：25 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：20 μL；流动相：A为甲醇，B为0.06%乙酸水溶液；洗脱梯度：0 ～ 1.0 min ７０％ Ｂ；1.01～7.0 min， 5% B；7.01～18.0 min， 70% B。

　　表1 红霉素和红霉素内标物的母离子／子离子及碰撞能量（略）

　　Table 1 Parent/daughter ions for erythromycin and internal standard

　　_定量离子（quantitative ion）。

　　质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正离子扫描，选择反应检测（SRM），喷雾电压： 4700 V，离子传输毛细管温度：300 ℃，源内碰撞诱导解离电压：8 V。鞘气：12.0 L/min，辅助气：2 L/min，红霉素及红霉素内标物的母离子、子离子及其碰撞能量见表1。

　　3 结果与讨论

　　3.1 流动相中乙酸含量对红霉素灵敏度的影响

　　选用不同含量的乙酸（0.06%, 0.3%,0.6%和1.2%）为流动相对红霉素进行分析。实验表明：随乙酸含量的增加，红霉素的灵敏度略有所增加。考虑到红霉素在酸性溶液中不稳定、易分解等原因，在满足测定灵敏度的前提下，尽可能选择酸度较低的流动相。本实验选择0.06% 乙酸水溶液作流动相。

　　3.2 质谱条件的优化及红霉素定性信息的确定

　　对红霉素标准溶液（1 mg/L）在正离子模式下进行全扫描，找出红霉素分子的 [M+1]+ 峰，以分子离子峰为母离子对离子源参数（喷雾电压、鞘气、辅助气、源内碰撞诱导解离电压）进行优化，使仪器灵敏度达到最高。然后再对红霉素的子离子进行全扫描,以确定红霉素的主要离子碎片。由实验结果可知，红霉素可产生3个主要碎片离子，它们的质核比（m/z）分别为：158.1,558.4和576.3,其中m/z 158.1和576.3离子强度较高、干扰较小；因此将m/z 158.1和m/z 576.3作为红霉素定性的依据。 红霉素的分子结构及碎片离子的断裂位置见图１，红霉素的二级质谱图见图2。

　　图1 红霉素和主要碎片离子的断裂位置（略）

　　Fig.1 Erythromycin and fracture position of major fragment ions

　　图２ 红霉素质谱图（略）

　　Fig.2 Mass spectra of erythromycin A

　　3.3 样品前处理方法的研究

　　3.3.1 提取剂的选择 食品中红霉素的残留大多采用乙腈[7,9～13]、氯仿[6]、甲酸盐溶液[5]等溶剂作为提取剂。本实验根据水产品的特性，分别选用了乙腈、二氯甲烷和甲酸盐3种溶剂作为提取剂，对阴性鲫鱼样品进行红霉素添加实验，通过回收率、本底干扰及方法的可操作性来评价提取剂。经对比实验得出：乙腈是最佳提取剂。乙腈作提取剂的优点是乙腈作为亲水性溶剂，很容易渗透到组织内部，提取效率高，脂肪含量少。而以甲酸盐溶液作提取剂时，水溶性蛋白质含量太高，无法进行后步处理。二氯甲烷沸点低，蒸发速度难以控制，红霉素在蒸发过程中损失较大，故不采用二氯甲烷作提取剂。

　　3.3.2 固相萃取净化时洗脱液用量的优化 样品经乙腈提取和正己烷净化后，溶液浑浊，仍含有很多杂质。因此，必须采用固相萃取柱进行净化。为保证红霉素能够从固相萃取柱上完全洗脱下来，对洗脱剂甲醇的用量进行了优化实验。实验中分别采用4、6、8和10 mL的甲醇对吸附有红霉素的固相萃取柱进行洗脱，以考察甲醇对红霉素的洗脱效率。实验结果表明：8 mL甲醇就可以使红霉素洗脱效率达到98%，所以洗脱剂甲醇的最佳用量为8 mL。

　　3.4 方法回收率、批内和批间精密度

　　选用不含红霉素的鱼、虾和蟹为测试对象，进行不同浓度红霉素加标回收实验，红霉素加标水平分别为1、5 和20 μg/kg，每个加标水平做6个平行实验，每个水平做4次加标，红霉素的加标回收率、批内精密度和批间精密度测定结果见表２。由表２可以看出，不论何种生物样品，红霉素的加标回收率均大于85%；批内相对标准偏差小于10%，批间相对标准偏差小于5%。由此可以看出本方法准确度高，重现性好。红霉素在鲫鱼样品中加标谱图见图3。

　　图3 鲫鱼加标样品的离子色谱图（略）

　　Fig．3 Ion chromatogram of fish sample spiked with erythromycin

　　表２ 回收率及精密度（略）

　　Table ２ Recovery and precision（n=6）

　　3.5 线性关系和方法检出限

　　精确配置一系列含有10 μg/L内标物的红霉素标准溶液，按2.3的条件进行分析，以红霉素与内标物的面积比（Y）为纵坐标，红霉素的质量浓度（X）为横坐标进行回归分析，由实验得出：红霉素在1～100 μg/L的范围内，呈良好的线性关系，相关系数为0.9999。回归方程为Y=0.05689+0.14997X。

　　以10倍信噪比为基准，本方法检出限为1.0 μg/kg。 红霉素在1.0 μg/kg加标水平下的回收率及精密度测定结果见表２。

　　３．６ 水产样品分析

　　从农贸市场购买草鱼、南美白对虾和中华绒螯蟹，每个品种3个样品，按2.2和2.3方法进行处理和测定，测定结果为草鱼、南美白对虾和河蟹中均未检出红霉素残留。

　　【参考文献】

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